倪挺：探索基因调控之复杂

本刊记者　徐芳芳

倪挺：探索基因调控之复杂

本刊记者徐芳芳

基因在肉眼看不到的世界里演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程，100多年来，科学家们通过解读基因储存的生命遗传信息，逐渐揭开了人类生命活动基本过程的面纱。

专家简介：

倪挺，1977年生于江苏省启东市，复旦大学生命科学学院教授、博士生导师。主要借助高通量测序技术及现代分子生物学等手段研究真核生物转录组的复杂性以及细胞衰老基因表达调控的分子机制。在Nature、Nature Methods、PNAS、PLoS Pathogens、Scientific Reports等国际期刊发表20余篇研究论文，获7项授权中国专利。入选中组部第三批“青年千人”计划和上海市“浦江人才计划”。担任国家科技部“973计划”课题负责人和科技部重大科学研究计划研究骨干，主持两项国家自然科学基金面上项目，是国家自然科学基金委创新研究群体的研究骨干。

从1909年丹麦遗传学家约翰逊在《精密遗传学原理》一书中正式提出“基因”概念，以此来替代孟德尔假定的“遗传因子”。“基因”一词便伴随着遗传学发展至今。

在神奇的生命世界里，科学家们寻找到这样一条所有细胞结构生物都遵循的“中心法则”，即遗传信息通过转录从DNA（脱氧核糖核酸）到RNA（核糖核酸），再通过翻译从RNA到蛋白质。

围绕这一“中心法则”，许多科学家对生命体的各个环节进行了深入的探寻，复旦大学生命科学学院倪挺研究员就是其中一员。近年来，倪挺因在基因表达最重要的调控手段之一——中心法则中的“转录”和衰老相关疾病的转录组复杂性等方面有了新的进展，在国际上受到了广泛认可。

生命科学之“梦”

“通过揭示和研究真核生物转录组的多样性，了解高等生物基因调控网络，并为深入理解人类疾病的复杂性提供理论依据。”这是倪挺从事生命科学研究以来一直坚持的梦想。朝着这一目标，他用自己对生命科学的热情一路求索、追寻，留下了精彩的足迹。

爱因斯坦说，兴趣是最好的老师。倪挺也说：“他和基因学有缘。”从小他就对生命世界充满了好奇，探索和求知的欲望使他慢慢推开了生命科学的大门。那时的他还不知道，门外，就是他的梦想。

1996年，倪挺以优异的成绩考入北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系。未名湖畔，博雅塔下，恰同学少年，风华正茂，在浓厚的学习氛围的熏陶下，他开启了生命科学之旅。从生物化学及分子生物学系学士学位到硕博连读植物学博士学位，10年的寒窗苦读，执着于梦想的他从未在探索生命科学领域的道路上停止过。

在生命科学植物分子生物学研究领域耕耘的林忠平教授的耐心指导下，倪挺对生命科学的理解逐渐由表及里，由浅入深。除了逐渐牢固生物研究基础知识之外，他开始在研究方法、研究手段上有所精进，形成了自有的研究哲学和风格。

在硕博连读期间，他就建立了中国第一个食物及花粉过敏原数据库（http://ambl.pku.edu.cn），被农业部指定为转基因食品安全过敏性评估专业机构，获得了北京大学最具份量的创新奖。同时，他还利用转基因技术获得了高表达小胰岛素原类似物的转基因灵芝，并证实口服转基因灵芝可以显著降低实验动物的高血糖，研究成果对于口服胰岛素的应用具有重要意义。

“科学探索永无止尽”，对倪挺来说更是如此。在北京大学博士毕业以后，他怀抱进一步深造的梦想，马不停蹄地跨出国门，开启了学术研究上的另一段重要征程。2007年～2010年进入美国杜克大学基因组科学与政策研究所在朱钧教授实验室从事博士后研究，2010年～2012年在美国国立卫生研究院（NIH）担任助理研究员。

5年的海外漂泊使倪挺有机会领略了国际最前沿的科研理念，炼就了洞察生命科学国际走向的“火眼金睛”。2012年，在国家紧缺创新型人才的时候，“羽翼丰满”的倪挺借第三批“青年千人计划”的“东风”回到了祖国，受聘为复旦大学生命科学学院研究员。

“我们要把人生变成一个科学的梦，然后，再把梦变成现实。”居里夫人说过的这句话用来形容倪挺再适用不过，他也希望有“梦照现实”的一天。不管前面的路是平坦还是布满荆棘，只要选择了远方，便只顾风雨兼程。正因为对生命科学的这份热情与执着，他收获了科研上的累累硕果。

三项技术探秘基因表达调控

随着高通量测序技术的飞速发展，人们对于转录组的认识也不断加深，许多新的剪接异构体、非编码RNA以及新的调控方式不断被发现，组成了一个神奇的RNA世界，也成为了一个新兴的热门领域。

在朱钧博士实验室，倪挺就接受了严格的现代分子生物学、细胞生物学以及基因组实验技术的训练，并且发展了新的多个基因组及转录组测序方法。他采用“分子条形码技术”，使得新一代测序技术中最具挑战性的序列较短的问题得以解决。该方法同时还能应用于白血病相关致病基因的早期低丰度突变的灵敏检测，目前，已申请了美国发明专利。

转录是基因表达关键的第一步。倪挺针对转录的三个环节，开发了三种新的高通量测序方法，这三项成果成为其研究生涯中的三大亮点。

针对转录起始环节，倪挺开发了双端测序方法，并首次在果蝇中发现三种转录起始模式，建立了其与启动子核心元件及表观遗传标记的关联性，从而丰富了对转录起始模式的认识。该技术同时为mRNA重新加帽（recapping）这一新现象提供了最为有力的证据，证明其广泛存在于转录组中。由于这一工作的重要性，Nature Reviews Genetics在论述转录组复杂性时还特别引用了他们的这一发现。

双端测序确定转录起始位点的方法发表于《Nature Methods》并被列为封面推荐。《Nature Methods》还以NEWS and VIEWS形式对倪挺的方法以及稍后时间发表的另一个相关方法进行了深度评述，并认为他们建立的方法极大地促进了转录起始位点研究。

随后，《Nature Reviews Genetics》 RNA富集在减数分裂和对环境胁迫应答的基因中，从而拓展了反义RNA新的生物学功能，丰富了人们对于真核生物转录调控复杂性的认识。

这是首次在单细胞生物中发现反义RNA参与了减数分裂这一与酵母生殖密切相关的重要过程。这一重要发现被随后的Science封面文章多次引用并加以证实。同时，该方法已被国内外10多个实验室采用并取得了很有意思的发现。

针对转录终止环节过程，倪挺建立了多聚腺苷酸精确定位测序方法（PA-seq）。这一方法的建立完善了对于转录过程从头到尾的研究，为研究选择性将他的这个方法作为RNA测序领域的一种重要方法给予介绍。论文同时被“基因组在线”这个在基因组研究领域具有重要影响力的网站在This week in Nature专栏中作为Nature Methods的唯一入选论文加以报道。这一方法同时也被介绍下一代测序技术的专著引用。关于转录起始模式和表观遗传学标记关联的发现也被Nature Reviews Genetics作为重要文献引用。

为了更好地从全基因组水平研究转录过程的调控，倪挺开发了定向连接介导的链特异性RNA-seq方法。利用这个方法，他首次在裂殖酵母中发现反义多聚腺苷酸化在基因调控中的重要作用提供了技术支撑。利用这个方法，他们测定了多个人体组织的polyA加尾位点，并取得了两个很有意思的发现。其一，选择性polyA加尾不仅在编码基因中存在，在非编码基因中也广泛存在；其二，发现了一组对人组织特异性具有调控作用的选择性Poly（A）新位点。

三项技术成果的组合使用对于全面理解和揭示真核生物转录组的复杂性，了解高等生物基因调控奠定了方法学基础，为深入理解人类疾病的复杂性提供了全新手段。

研发线粒体DNA低频突变深度测序方法

近10年来，衰老相关疾病显著增加，而且一些疾病逐渐呈年轻化发展。衰老是一个渐进的缓慢过程，其必然包括某些基因成千上万个拷贝的渐进性序列改变，而哺乳动物细胞中，只有线粒体这个遗传系统有上千拷贝，从0～100％渐进的遗传变异。

线粒体DNA（mtDNA）是母系遗传，并有较大的遗传变异，这些遗传变异是使得人类能够适应环境改变的一个重要因素。每个细胞含有百计的线粒体和千计的线粒体DNA（mtDNA），研究表明，线粒体功能衰退和mtDNA的损伤被认为在衰老及其相关疾病中起着重要的作用，也和诸多疾病，如耳聋、心脏病、肾病等退行性疾病有关系。近几十年来，研究者们提出各种衰老假说，并不断聚焦于线粒体。随着mtDNA分子生物学研究的深入，mtDNA在疾病中的作用逐渐为人们所重视。

在以前的研究中，由于检测技术的限制，多数研究关注与mtDNA的缺失突变和高频点突变导致的生物学后果，而对低频点突变导致衰老及相关疾病的研究不足，特别是总体而言，mtDNA突变到什么程度才能引起衰老更是知之寥寥。

回答mtDNA突变（特别是低频点突变）与衰老研究中的未解之谜，可靠测定线粒体低频点突变的技术是前提。随着高通量测序技术的飞速发展，测序的深度和覆盖度不断加深，使得之前所不能实现的低频点突变检测有了可能。

然而，近几年出现的基于深度测序来测定线粒体突变的方法都存在一定的局限性：从细胞中分离线粒体，再提取线粒体DNA并构建文库进行深度测序的方法涉及到线粒体的分离，操作复杂繁琐，工作量大；基于聚合酶链式反应（PCR）扩增的深度测序方法覆盖度均一性较差，易于引入低频突变，干扰真正低频突变的检测；序列捕获方法不能有效区分来自核基因组的线粒体假基因。

为了克服以上方法的缺点，倪挺及其科研团队研发出了一种更简单、更高效的线粒体DNA低频突变深度测序方法。这种方法通过设计一组线粒体DNA特异的引物，采用滚环复制（RCA）从总DNA中富集线粒体DNA，并通过特定的限制性内切酶进一步富集线粒体DNA，然后构建测序文库并进行高通量测序，并开发特定的数据分析流程，从而达到测定线粒体基因组中低频率变异的目的。

RCA比PCR保真性大大增强，酶切过程克服了核基因组线粒体假基因的干扰。这两方面的优势使得倪挺研发的新技术能够可靠检测低至0.3％的mtDNA低频点突变。这一精度足够倪挺所在的科研团队检测频率＜2％的点突变，因此突破了技术限制，为解决mtDNA低频突变与衰老研究之间的关系提供了新的可能。

基于这一检测方法，倪挺及团队在线粒体DNA聚合酶g（Polg）基因突变导致mtDNA复制修复功能缺失的小鼠中进行了验证，发现突变小鼠的mtDNA低频点突变显著高于野生型小鼠，并发现不同组织具有不同数目的低频点突变，mtDNA聚合酶（Plog）基因突变导致早衰的小鼠中mtDNA突变水平的升高主要是由于低频点突变的位点数目增加，而已有突变位点的频率增加则居次要地位。更有意思的是，Polg基因突变小鼠中有更多的胞嘧啶（C）变成胸腺嘧啶（T），使得更多亲水氨基酸变成疏水性，提示低频点突变的累积可能是导致早衰表型的原因。

在科研的不断深入的同时，倪挺带领科研团队申请到了国家自然科学基金面上项目，在接下来的研究中，他将以“线粒体DNA低频点突变在衰老中的影响及机制”为研究重点，利用自主开发的线粒体DNA低频点突变检测新方法，以具有早衰表型的小鼠和正常衰老的小鼠为研究对象，结合最新的基因编辑技术（实现基因定点突变）、链特异性RNA-seq技术（研究线粒体DNA低频点突变的基因表达）以及其他必要的分子生物学手段，阐明线粒体DNA低频点突变在不同衰老类型中随衰老进程的变化规律以及mtDNA在不同组织具有不同突变频率/速度的内在机制。

目前，为了能够深入研究这一课题，倪挺组织力量进一步加强实验和生物信息学的结合，解读线粒体基因及核基因组所携带的遗传信息传递过程，探索生命这个复杂系统的奥秘。与此同时，他也一直在为炼就一支精于科研的团队，为生命科学培养出更多的精英，研发新技术而忙碌。

对于未来的规划，倪挺心中已再清晰不过了。站在黄浦江畔，立身于复旦这所在学术研究上享誉全球的巍巍大学，倪挺用科研成果诠释着自己对生命科学的热情与执着。