帽儿山异色瓢虫野外越冬前体内甘油·脂肪含量的变化

姜 礅，王世新，丁晓霞，孟昭军

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040)



帽儿山异色瓢虫野外越冬前体内甘油·脂肪含量的变化

姜 礅，王世新，丁晓霞，孟昭军*

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040)

[目的]明确野外越冬异色瓢虫[Harmoniaaxyridis(Pallas)]成虫体内甘油、脂肪2种物质越冬前的动态变化。[方法]利用动力学方法和重量法，分别测定了其体内甘油和脂肪含量。[结果]昼长及温、湿度共同影响异色瓢虫越冬前体内甘油和脂肪含量的变化；在异色瓢虫越冬前，虫体脂肪含量达到最低值，于部分异色瓢虫越冬期间达到最高值；而虫体甘油含量在异色瓢虫越冬前期及部分异色瓢虫越冬期间达到最高值，在几乎全部异色瓢虫越冬期间降到最低值；甘油、脂肪含量变化与昼长及温、湿度变化呈一定相关性，但不显著。[结论]异色瓢虫体内甘油与脂肪含量在越冬前呈互补变化，在部分及全部异色瓢虫越冬期间均呈现上升和下降相似变化，其相应生化指标可作为异色瓢虫越冬的指示。

异色瓢虫；越冬；甘油；脂肪

异色瓢虫属鞘翅目瓢虫科，是介壳虫、蚜虫、红蜘蛛等害虫的主要天敌，对其进行保护和利用是当今保护生态环境、防止农药污染、加强绿色食品生产的重要方法之一[1]。目前其作为一种重要的生防天敌，在全世界农业生产中广泛应用[2]。

耐寒性昆虫通过维持虫体的过冷却状态忍受冻害，过冷却能力的维持与其体内生化物质的种类、含量变化密切相关[3]。昆虫越冬期间体内积聚小分子量的糖或醇(如甘油、多元醇、糖等)，这些抗冻保护物质可以增加昆虫体内束缚水的含量，或直接与酶等其他蛋白质相互作用起到保护生物系统的作用[4-5]。甘油是昆虫体内一种重要的抗冻保护剂，可保护细胞膜和蛋白质并提高昆虫体液的过冷却能力[6]。低温暴露过程中脂肪贮存对异色瓢虫的存活是非常重要的[7]。影响昆虫休眠与滞育的外界环境条件有光周期、温度、水分、食物等[8]。越冬异色瓢虫的存活率和存活时间也与保存温度、相对湿度有密切关系[9]。目前国内主要通过对异色瓢虫实验种群进行人工冷驯化的方法来研究该虫的抗寒机制，对异色瓢虫在自然状态下的越冬机制研究甚少。为了进一步了解异色瓢虫的抗寒机制，笔者研究该虫体内甘油和脂肪在野外自然状态下越冬期间的变化动态与抗寒性的关系，以期为深入研究其发生发展规律及保护利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试瓢虫。野外越冬异色瓢虫成虫采自黑龙江省尚志市帽儿山镇老爷岭山上的3栋向阳废弃的小木屋中，采集时间为2013-10-07、2013-10-19、2013-11-02、2013-11-16、2013-11-30、2013-12-07、2014-05-11。试虫采回后放于光照培养箱24 h[(25.0±1.5)℃，光暗周期为16∶8 h，相对湿度(70±5)%，选择活动自如的个体放在-42 ℃的低温冰箱里冷冻保存，作为甘油和脂肪含量测定的试虫。

1.1.2供试药剂。高碘酸钠、无水醋酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮、异丙醇、蒸馏水；氯仿、甲醇、盐酸、无水乙醇、无水乙醚、石油醚和甘油均为分析纯，均由天津市永大化学试剂有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1越冬前期异色瓢虫体内甘油含量的测定[10]。

1.2.1.1甘油标准液配制。取1.0 g甘油放到1 000 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，再从中取2.50 ml溶液于100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容。

1.2.1.2甘油标准曲线绘制。将21支试管平均分为3组，每组作1个重复。每组7支试管分别加入 0、0.12、0.24、0.36、0.48、0.60、0.72 ml 甘油标准液(25 μl/ml)，用蒸馏水补足至1.00 ml。然后在每支试管中加入氧化剂2.00 ml(130 mg 高碘酸钠、8 g无水醋酸铵、6.00 ml冰醋酸，待全部溶解后加蒸馏水定容至100.00 ml),摇匀，加入显色剂2.00 ml(乙酰丙酮0.40 ml，加异丙醇溶解定容至100.00 ml)充分混合后，60 ℃水浴中加热显色15 min，冰水冷却。在414 nm波长下，用紫外分光光度计测定并记录各样品的吸光值。以甘油含量为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.1.3试虫甘油含量测定。分别取同一日期采集的健康异色瓢虫3头，蒸馏水冲洗，吸水纸吸干虫体表面水分，置预先称重的 EP管中称重后，放入研钵中，加1 400 μl 蒸馏水研磨，匀浆液转入1.50 ml EP管中。用1 600 μl蒸馏水分2次冲洗研钵，溶液转入EP管中，5 000 r/min离心10 min，将上清液装入10 ml带塞玻璃试管中。沉淀加入1 000 μl蒸馏水涡旋混匀后再离心1次，合并上清液待测，用蒸馏水定容到50.00 ml。取1.00 ml待测液与标准液相同测定方法进行氧化、 显色和比色分析。每个处理重复3次。

1.2.2越冬前期异色瓢虫体内脂肪含量的测定。将瓢虫置于60 ℃恒温培养箱干燥48 h后，称量虫体干重。取干燥后的成虫(3或2头，干重质量M)于玻璃匀浆器中，加入3.00 ml氯仿和甲醇提取液(氯仿∶甲醇=2∶1,V/V)研磨成匀浆(3.00 ml提取液，先用1.40 ml研磨，再分别用0.80 ml洗涤匀浆器)，转移至5 ml离心管中,5 000 r/min离心10 min。转移上清，沉淀中再加入3.00 ml氯仿和甲醇提取液，再次离心，转移上清。剩余沉淀在60 ℃恒温培养箱中干燥24 h至恒重，称得质量m。将上清液混合后放于蒸发皿或试管中，60 ℃水浴蒸干，取出放在干燥器中，冷却后称得脂肪质量x。1.2.3光周期昼长的计算及室内温、湿度的测量。

1.2.3.1光周期昼长的计算。以黑龙江省哈尔滨市阿城区、尚志市、延寿县三地(样品采集地位于三地区中间)光周期昼长为重复，在百度网上查询三地在采样日期当天的日出、日落时间，再分别求出三地光周期昼长，以三地昼长的平均值作为样品采集地的光周期昼长。

1.2.3.2室内温、湿度的测量。在9月末，将温湿度自动记录仪放在小木屋室中央位置，温湿度探头悬在空中，距地面约1 m，温湿度数据记录频率为1次/h，数据连续记录到翌年5月中旬。计算采样日期前3 d每天的温、湿度数据平均值，将其分别作为采样日期温、湿度的3个重复数据，再计算其均值作为采样当天的日平均温度与日平均相对湿度的数据。

1.2.4数据统计。脂肪含量直接测量法：脂肪含量=x/M×100%。根据待测液的吸光值，在标准曲线上查出相应的甘油含量，按下式计算试虫体内甘油成分的实际含量：虫体甘油含量(μg/mg)=(从标准曲线查得的甘油含量×样品稀释量)/虫重。通过Excel表格统计甘油和脂肪含量数据并做图，利用SPSS17.0对前6次甘油和脂肪含量数据分别与温、湿度和昼长的数据统计结果进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 野外异色瓢虫越冬前期未滞育调查由表1可知，在2013年11月2日之前，异色瓢虫未滞育；在11月16日，温度逐渐接近0 ℃，昼长低于10 h之后，滞育率接近50%；而在12月21日，随着温度、昼长和湿度进一步降低到-8.9 ℃、8.72 h和48.7%时，异色瓢虫几乎全部滞育。

2.2 异色瓢虫体内甘油含量的变化与温度、湿度、昼长的关系由图1可知，在2013年11月30日之前，随着越冬场所环境温度逐渐降低，甘油含量呈小幅波动，并在11月30日达到最高值(2.0 μl/mg)，而在12月7日甘油含量下降至最低值(0.7 μl/mg)，甘油含量变化与温度呈低度相关(r=0.300，P=0.563)；2014年5月11日随春天温度的回升，甘油含量逐渐增加。

图2和图3表明，2013年12月7日之前，随着越冬场所相对湿度波动降低，昼长逐渐缩短，甘油含量在12月7日下降至最低值。甘油含量变化与相对湿度呈中度相关(r=0.554，P=0.307)，与昼长也呈中度相关(r=0.509，P=0.302)。

2.3 异色瓢虫体内脂肪含量的变化与温度、湿度、昼长的关系由图4～6可知，随着环境温、湿度及昼长的变化，虫体平均脂肪含量在11月2日之前逐渐减少，由0.48%下降至0.38%；在11月2日至11月30日脂肪含量逐渐增加，由0.38%增加至0.47%；而在11月30日之后，脂肪含量又逐渐减少。脂肪含量变化与温度变化无相关性(r=0.184，P=0.728)，与相对湿度变化呈低度负相关(r=-0.394，P=0.440)，与昼长变化也呈低度相关(r=0.470，P=0.347)，但2014年5月11日，随着春天温湿度的升高及昼长延长，脂肪含量无显著变化。

2.4 异色瓢虫体内脂肪含量与甘油含量的变化关系由图7可知，在越冬前期异色瓢虫体内甘油含量缓慢增加，而脂肪含量却逐渐减少；在异色瓢虫越冬期，两者变化趋势相似。甘油与脂肪含量变化呈低度相关，但不显著(r=0.384，P=0.452)。

3 结论与讨论

光周期和温度为昆虫滞育诱导、维持和终止的主要因素，光周期和温度相互影响[11-12]。温度对异色瓢虫的存活影响最大，湿度次之，温湿度的交互作用不大[9]。该研究表明，昼长、温度和湿度共同影响异色瓢虫越冬前体内甘油和脂肪含量的变化；虫体脂肪含量在2013年11月2日异色瓢虫开始进入越冬前达到最低值，于11月30日部分异色瓢虫进入越冬期间达到最高值；而虫体甘油含量在2013年11月2日达到越冬前的最高值，于11月30日部分异色瓢虫进入越冬期间再次达到最高值，在12月7日几乎全部异色瓢虫进入越冬期间降至最低；甘油、脂肪含量变化与昼长、温度和湿度变化呈一定相关性，但不显著，与已有文献不完全相符，可能与野外温、湿度剧烈变化有关。

甘油是一种防冻剂，它的合成是越冬昆虫对抗环境因子(特别是低温)影响的一种固有的模式[13]。甘油的积累可以通过降低冰点和过冷却点来提高昆虫的抗寒能力[10]。研究发现，在越冬前期甘油含量随昼长、环境温度、湿度的降低而缓慢增加，后又随着温度的回升而减少。可能在越冬前期，随着昼长、温度和湿度的持续降低，甘油作为一种抗冻保护物质保护虫体不受伤害而未被积累；温度回升之后，异色瓢虫体内的代谢增强需要消耗的能量也增加，部分甘油作为供能物质被消耗，是该虫正常的生理机能反应。

低温影响昆虫活动和取食等行为，在低温情况下，预先进行的脂肪储备以及代谢中能量的节约对昆虫的存活也是非常重要的[14]。该研究发现，在越冬开始时，受昼长、温度和湿度降低的影响，异色瓢虫体内脂肪含量缓慢下降，可能是由于昆虫取食受到影响，部分游离的脂肪被该虫消耗所造成。而随温度进一步降低，昼长缩短，脂肪含量缓慢增加，为抵御越冬后温度降低而被积累。脂肪作为一种重要的抗冻保护物质增加昆虫的抗寒性。当温度逐渐回升时脂肪含量再次缓慢减少，是脂肪作为一种供能物质被消耗，以供应虫体代谢增强所需能量的代谢反应。

桑螟幼虫在越冬期体内游离脂肪一部分转换为结合脂肪，一部分转化为甘油和游离脂肪酸并进入血淋巴，以提高抗寒能力[15]。该研究表明，异色瓢虫在越冬期体内脂肪和甘油也存在类似转换，在越冬前期异色瓢虫体内的部分脂肪转换为甘油，造成刚越冬时脂肪含量减少，而甘油含量增加。

每年春天来临，随着昼长延长以及环境温、湿度增加，多数昆虫滞育诱导期积累糖原，而在滞育解除时转化为糖类和醇类[16]。该研究发现在异色瓢虫解除滞育期间，甘油含量快速增加是由于部分糖原的转换造成的；而脂肪含量不变则是由于部分碳水化合物被消耗代替脂肪为虫体解除滞育提供能量所致。

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The Changes of Glycerinum and Fat Contents ofHarmoniaaxyridisbefore Natural Wintering in the Maoershan Mountain

JIANG Dun, WANG Shi-xin, DING Xiao-xia, MENG Zhao-jun*

(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] In order to illuminate the dynamical changes of glycerinum and fat contents ofHarmoniaaxyridisbefore natural wintering. [Method] Their glycerinum and fat contents were determined by dynamical and weight method. [Result] The results showed changes of glycerinum and fat contents were affected by temperature, relative humidity and daylength. The fat contents were the lowest before natural wintering ofH.axyridisand were the biggest during natural wintering of manyH.axyridis. Then glycerinum contents were the biggest before natural wintering ofH.axyridisand during natural wintering of manyH.axyridis. While glycerinum contents were the lowest during natural wintering of most ofH.axyridis. There was not significant correlation both changes of glycerinum and fat contents and temperature, relative humidity and daylength. [Conclusion] The results founded the complementary changes of glycerinum and fat contents were presented before natural wintering ofH.axyridis. The ascending and descending changes of glycerinum and fat contents were presented during natural wintering of many and most ofH.axyridis. Their biochemical criterion was regard as the symbol ofH.axyridisentering a diapause.

Harmoniaaxyridis(Pallas); Overwintering; Glycerinum; Fat

东北林业大学大学生创新创业训练计划项目(201310 225009)。

姜礅(1993- )，男，湖南邵阳人，本科生，专业：森林资源保护与游憩。*通讯作者，讲师，博士，从事昆虫化学生态与害虫生物防治研究。

2014-12-18

S 433.5

A

0517-6611(2015)04-125-03