不同发酵类型的茶叶原花青素含量的比较分析

采用超声波法从不同发酵类型的茶叶中提取原花青素化合物，通过正交实验确定了最佳提取条件，并建立了原花青素的光谱分析方法.方法的回收率为99.15%～104.50%，相对标准偏差小于1.27%.结果表明，3种不同发酵类型的茶叶中原花青素的含量情况是：不发酵的绿茶含量最多，其次是半发酵青茶，全发酵红茶含量最少.

原花青素(Procyanidins，简称PC)是指从植物中分离得到的一类在热酸处理下能产生花色素的多酚化合物.近年来,该类化合物所体现的生物活性屡见报道,如抗氧化和清除自由基等[1～6],这些引起了人们极大的关注.目前,关于原花青素的测定方法还无统一标准,而文献报道的几种方法中,正丁醇法[7]受原花青素结构的影响较大,对于低聚合度原花青素的测定并不适宜，香草醛-硫酸法[8]由于硫酸的强氧化作用也使得测定结果偏低.本文在低浓度香草醛-盐酸法[9]基础上进行了改进,采用超声波法提取不同发酵类型茶叶中原花青素，对提取条件进行了正交实验，对不同发酵类型茶叶中原花青的含量进行比较分析.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-036紫外分光光度计(美国Varian公司)；RE-52C旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂).

原花色素标准品：天津市金测分析技术有限公司;甲醇、氯仿、乙酸乙酯、盐酸、香草醛等试剂均为分析纯.

1.2 实验样品

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制精确称取0.010 g原花青素标准品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释溶解定容至刻度，得到浓度为1.00 mg/mL标准品储备液，摇匀，备用.

1.3.2 样品前处理及样品溶液的制备将茶样品粉碎，过0.45 mm的筛，得茶样品粉末.

准确称取茶样品粉末2.00 g置于50 mL锥形瓶中，加入10 mL 90%甲醇溶液，在20 ℃下超声提取4次，每次提取60 min[10]，再放入离心机中，以3 000 r/min离心20 min后，合并提取液并从中准确移取1 mL提取液至10 mL容量瓶中，用90%甲醇定容，摇匀，作为样品储备液备用.

1.3.3 原花青素吸收曲线的绘制及测定波长的确定准确吸取1.3.1标准溶液1 mL，置于10 mL具塞试管中，加入5 mL 1∶1混合的1%的香草醛-8%盐酸溶液，放入30 ℃的水浴中避光加热30 min，后取出静置至室温，在波长400～800 nm范围内扫描，最大吸收波长为497.0 nm，如图1.

准确移取1.3.2样品储备液1 mL，置于10 mL具塞试管中，加入5 mL 1∶1混合后的1%的香草醛-8%盐酸溶液，在30 ℃的水浴中避光加热30 min，后取出静置至室温，在波长400～800 nm范围内扫描，最大吸收波长为497.0 nm，如图2.

由图1和图2看到，原花青素可做为测定的标准品，测定波长为497.0 nm.

1.3.4 标准曲线的绘制分别取0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70 mL的原花青素标准溶液于10 mL具塞试管中，加入5 mL1∶1混合的1%的香草醛-8%盐酸溶液，放入30 ℃的水浴中避光加热30 min，取出静置至室温.在吸收波长为497.0 nm处测定A值，A与浓度关系的回归方程为:A=1.179 8×C-0.010 7，相关系数r=0.999 2，在0.10～0.70mg/mL范围内，A与浓度C呈良好线性关系如图3所示.

1.3.5 测定方法将3种茶样分别按1.3.2处理，在497.0nm波长下分别测定其吸光度值，每个样品测定3次，按标准曲线法求出其原花青素的含量.

2 结果分析

2.1 超声波提取茶样中原花青素的正交实验

采用正交设计的方法对甲醇溶剂浓度、超声提取时间、次数、温度因素进行实验[11]，确定茶样中原花青素的最佳提取条件见表1.

正交实验设计与数据分析：取16份茶样品，按表1正交设计方法进行实验，结果见表2和表3.

由表3正交实验的方差分析可知，由于D的偏差平方和>C的偏差平方和>B的偏差平方和>A的偏差平方和，所以4种因素对实验结果的影响依次为超声温度、次数、时间、甲醇溶剂浓度值.分析结果表明，最佳提取条件为：D1C2B4A4，即为：超声温度20 ℃、超声次数4次、超声时间60min、甲醇溶剂浓度值为90%.

2.2 样品稳定性实验

用1.3.2的方法配制的茶样品进行稳定性实验，结果表明：样品放置120min，测得其吸光度值基本不变.

2.3 方法精密度实验

制备一定浓度的标准品溶液，测定9次，求得其标准偏差及变异系数，结果列于表4.

2.4 方法回收率实验

取相同浓度的样品，按标准加入法加入3个不同浓度的原花青素标准品溶液，测定A值，带入回归方程，计算回收率，结果见表5.

2.5 样品中原花青素含量的测定

3种茶样在497.0nm波长下分别测定其吸光度值，按标准曲线法定量分析出其中所含原花青素的含量，结果列于表6.

3 结论

实验结果表明3种不同发酵类型的茶叶中原花青素的含量情况是：不发酵的绿茶含量最多，其次是半发酵青茶，全发酵红茶含量最少，说明茶叶中原花青素的含量随着发酵程度增大而减少.

原花青素是自然界中广泛存在的聚多酚类混合物，研究表明，原花青素具有抗氧化、清除自由基、抑制肿瘤、抗诱变的能力.目前国内外的研究仅限于对葡萄、山楂、银杏、高粱等等植物中原花青素的研究[12～14]，对于茶叶中原花青素的研究少见报道.因此对茶叶中原花青素含量的分析很有必要，可以丰富我国原花青素的天然植物资源，为进一步开发利用茶叶起到一定推动作用.

[2]JosepLT,BegonaV,MariaTG,etal.Valorizationofgrape(vitisviniferal)byproducts.Antioxidantandbiologicalpropertiesofpolyphenolicfractionsdifferinginprocyanidincompositionandflavonolcontent[J].JAgricFoodChem,2002,50:7548-7555.

[3]TeissedrePL,FrankelEN,WaterhouseAL,etal.InhibitionofinvitrohumanLDLoxidationbyphenolicantioxidantsfromgrapesandwines[J].JSciFoodAgric,1996,70:55-61.

[4]Santos-BuelgaC,ScalbertA.Proanthocyanidinsandtannin-likecompounds-nature,occurrence,dietaryintakeandeffectsonnutritionandhealth[J].JSciFoodAgric,2000,80:1094-1117.

[5]BagchiD,GargA,KrohnRL,etal.OxygenfreeradicalscavenrrgingabilitiesofvitaminsCandEandagrapeseedproanthocyanirdinextractinvitro[J].ResCommunMolPatholPharmacol,1997,95(2):179-189.

[6] 冯建光,陈利琼.葡萄籽提取物中原花青素的测定[J].中国食品添加剂,2003,6:103-105.

[7]PorterL,HrstichL,ChanB.Theconversionofprocyanidinsandprodelphinidinstocyanidinanddelphinidin[J].Phytochemistry，1985,25:223-230.

[8]DeshpandeS,CherycmMJFood.Evaluationofvanillinassyfortanninanalysisofdrybeans[J].Sci,1985,50:905-910.

[9] 李春阳,许时婴,王璋.低浓度香草醛-盐酸法测定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J].食品工业科技分析检测,2004,25(6):128-130.

[10] 侯冬岩,回瑞华,刘晓媛.黑茶黄酮的光谱分析及抗氧化性能研究[J].鞍山师范学院学报,2009,11(4):21-24.

[11] 谢丽源,王富伟,李洪军.超声波复合酶法提取桑黄多糖研究[J].食品科学,2010,31(10):81-55.

[12] 吕丽爽,曹栋.葡萄籽低聚原花青素抗氧化性的研究[J].食品科技,2000(4):41-42.

[13] 凌智群,张晓辉，谢笔钧.原花青素的药理学研究进展[J].中国药理学通报,2002,18(1):9-12.

[14] 赵超英.葡萄籽提取原花青素的营养保健功能[J].中国食品卫生杂志,2000,12(6):38-41.The comparative analysis of procyanidins content in different types of fermentation teas

(SchoolofChemistryandLifeScience,AnshanNormalUniversity,AnshanLiaoning114007,China)

Ultrasonic method is used to extract procyanidins from different types of tea fermentation compounds,the best extraction conditions were determined through orthogonal experiment,and establish the spectral analysis method of procyanidins.Method of recovery is 99.15%～99.15%,relative standard deviation less than 1.27%.Results show that the three different types of tea fermentation zhongyuan anthocyanin content is:not fermented green tea most abundant,followed by half fermented oolong tea,all is least fermented black tea. Key words different types of fermentation tea;procyanidins;ultrasonic method;orthogonal test

侯冬岩(1962-)，男,吉林省吉林市人，鞍山师范学院化学与生命科学学院教授，主要从事天然功能食品科学研究.