一氧化碳释放分子对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其作用机制研究

刘红英

·论著·

一氧化碳释放分子对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其作用机制研究

刘红英

目的探讨一氧化碳释放分子(CORM)对病毒性心肌炎(VMC)小鼠的保护作用及其作用机制。方法将45只4周龄雄性纯种BALB/C小鼠随机分为正常对照组、空白对照组及CORM干预组，每组15只，制备VMC模型，CORM干预组小鼠予以3 mg/ml CORM溶液0．1 ml腹腔注射，正常对照组和空白对照组小鼠予以二甲基亚砜0．1 ml腹腔注射，记录各组小鼠死亡数量，检测各组小鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)浓度及心肌匀浆液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)、过氧化氢酶(CAT)、IL－1β、IL－6、IL－18、肿瘤坏死因子α(TNF－α)浓度，计算各组小鼠心肌病变积分。结果正常对照组、CORM干预组小鼠病死率均低于空白对照组(P＜0．05);空白对照组血清cTnI浓度、心肌病变积分高于正常对照组和CORM干预组，CORM干预组血清cTnI浓度、心肌病变积分高于正常对照组(P＜0．05)。空白对照组心肌匀浆液MDA浓度高于正常对照组和CORM干预组，心肌匀浆液SOD、GSH－Px、CAT浓度低于正常对照组和CORM干预组，而CORM干预组心肌匀浆液MDA浓度高于正常对照组，心肌匀浆液SOD、GSH－Px、CAT浓度低于正常对照组(P＜0．05)。空白对照组心肌匀浆液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α浓度高于正常对照组和CORM干预组，CORM干预组心肌匀浆液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α浓度高于正常对照组(P＜0．05)。结论CORM可降低VMC小鼠病死率及心肌损伤，具有一定的保护作用，其作用机制可能包括抑制脂质过氧化、减轻炎性反应等。

心肌炎;病毒性疾病;一氧化碳释放分子;氧化性应激;炎症;小鼠，近交BALB C

病毒性心肌炎(VMC)是指由柯萨奇B组病毒(CVB)等亲心肌病毒感染所致的弥漫性或局限性心肌炎性病变，是临床常见的心血管疾病之一。近年研究证实，氧化应激及炎性反应在VMC的发生和发展过程中发挥着重要作用［1］。一氧化碳(CO)是继一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)之后发现的重要的气体信号分子，其在体内主要由血红素氧合酶(HO)催化血红素降解产生［2］。一氧化碳释放分子(CORM)是一种由过渡金属组成的羰基化合物，在生理条件下可持续地释放CO，可作为较好的外源性CO供体［3］。研究发现，CORM对某些炎性疾病(如牙周炎等)具有保护作用［4］，但目前关于其对VMC保护作用的研究报道较少。本研究通过柯萨奇B3病毒(CVB3)Nancy株感染BALB/C小鼠而建立VMC动物模型，观察CORM对VMC小鼠病死率、血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)浓度、心肌病变、氧化应激物质及炎性递质的影响，探讨CORM对VMC小鼠的保护作用及其作用机制，为VMC的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料实验组动物为4周龄雄性纯种BALB/C小鼠，共45只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，批号:SCXK京2002－0003，体质量12～16 g，无特定病原体(SPF)环境饲养。CORM购于美国Sigma公司，实验时需溶解于二甲基亚砜制成3 mg/ml溶液。CVB3 Nancy株Hela细胞感染率(TCID50)为1 ×107，实验时用量为1×102TCID50。

1．2 模型制备将45只小鼠随机分为正常对照组、空白对照组和CORM干预组，每组15只。正常对照组小鼠腹腔内注射不含CVB3的Eagle's液0．1 ml，空白对照组、CORM干预组小鼠腹腔注射相同剂量的含1×102TCID50CVB3的Eagle's液0．1 ml，建立VMC动物模型。各组小鼠均造模成功，次日CORM干预组小鼠予以3 mg/ml CORM溶液0．1 ml腹腔注射，正常对照组和空白对照组小鼠予以二甲基亚砜0．1 ml腹腔注射，均为1次/d，连续注射2周，记录各组小鼠死亡数量。2周后，采集各组存活小鼠外周血(用于分离血清)后全部处死，摘取心脏，以左心室中线为界将心脏切为两半，其中一半固定于10%甲醛溶液，另一半保存于－70℃冰箱。

1．3 HE染色方法常规石蜡包埋心肌组织，5 μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，常规HE染色后梯度乙醇脱水、封片，在光镜下观察各组小鼠心肌改变。参考文献［5］中的方法计算心肌病变(炎性浸润与坏死)积分，即每张切片随机选择5个高倍视野，计算每个高倍视野中炎性细胞浸润和坏死区域面积占整个视野面积的百分比，取平均值;无病变计0分，病变面积＜25%计1分，病变面积为25%～50%计2分，病变面积为50%～75%计3分，病变面积＞75%计4分。

1．4 血清cTnI浓度检测方法取50 μl血清，采用化学发光法检测各组小鼠血清cTnI浓度，检测试剂盒购自Dade Behring Inc公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1．5 心肌匀浆液氧化应激物质浓度检测方法取各组小鼠适量心肌组织匀浆，离心、提取上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测蛋白浓度，再采用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测心肌匀浆液丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)、过氧化氢酶(CAT)浓度。

1．6 心肌匀浆液炎性递质浓度检测方法取各组小鼠适量心肌组织匀浆，离心、提取上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测蛋白浓度，再采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠心肌匀浆液IL－1β、IL－6、IL－18、肿瘤坏死因子α(TNF－α)浓度，试剂盒均由深圳晶美生物技术有限公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1．7 统计学方法采用SPSS 16．0软件进行统计学分析，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析;计数资料采用χ2检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 病死率、血清cTnI浓度及心肌病变积分正常对照组小鼠死亡0只，空白对照组小鼠死亡7只(7/15)，CORM干预组小鼠死亡2只(2/15)，正常对照组、CORM干预组小鼠病死率均低于空白对照组(χ2值分别为0．00、0．05)，差异有统计学意义(P＜0．05)，但CORM干预组与正常对照组比较，差异无统计学意义(χ2=0．14，P＞0．05)。3组小鼠血清cTnI浓度、心肌病变积分比较，差异有统计学意义(P＜0．05);其中空白对照组血清cTnI浓度、心肌病变积分高于正常对照组和CORM干预组，CORM干预组血清cTnI浓度、心肌病变积分高于正常对照组，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表1)。

表1 3组小鼠血清cTnI浓度、心肌病变积分比较(±s)Table 1 Comparison of serum cTnI level，myocardial lesions score in the three groups of rats

表1 3组小鼠血清cTnI浓度、心肌病变积分比较(±s)Table 1 Comparison of serum cTnI level，myocardial lesions score in the three groups of rats

注:与正常对照组比较，*P＜0．05;与空白对照组比较，△P＜0．05;cTnI=心肌肌钙蛋白I

组别只数cTnI(μg/L)心肌病变积分(分) 150．09±0．020空白对照组80．38±0．07*2．86±0．54*CORM干预组130．15±0．03＊△1．35±0．28＊△F正常对照组0．0000．000 147．31241．93 P值值

2．2 心肌匀浆液氧化应激物质浓度3组小鼠心肌匀浆液MDA、SDA、GSH－Px、CAT浓度比较，差异有统计学意义(P＜0．05);其中空白对照组心肌匀浆液MDA浓度高于正常对照组和CORM干预组，心肌匀浆液SOD、GSH－Px、CAT浓度低于正常对照组和CORM干预组，而CORM干预组心肌匀浆液MDA浓度高于正常对照组，心肌匀浆液SOD、GSH－Px、CAT浓度低于正常对照组，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表2)。

表2 3组小鼠心肌匀浆液氧化应激物质浓度比较(±s)Table 2 Comparison of oxidative stress index of myocardial serous in the three groups of rats

表2 3组小鼠心肌匀浆液氧化应激物质浓度比较(±s)Table 2 Comparison of oxidative stress index of myocardial serous in the three groups of rats

注:与正常对照组比较，*P＜0．05;与空白对照组比较，△P＜0．05;MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶，GSH－Px=谷胱甘肽过氧化物酶，CAT=过氧化氢酶

组别只数MDA (nmol/mg蛋白) SOD (U/mg蛋白) GSH－Px (U/mg蛋白) CAT (U/mg蛋白)．18空白对照组8138．46±16．31*27．39±3．76*9．56±1．43*16．25±2．83*CORM干预组1383．49±10．48＊△52．18±6．54＊△21．54±3．62＊△31．45±4．37＊△F正常对照组1571．89±9．3767．42±8．1725．71±4．2837．42±6 90．0789．3453．1347．38 P值值0．0000．0000．0000．000

2．3 心肌匀浆液炎性递质浓度3组小鼠心肌匀浆液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α浓度比较，差异有统计学意义(P＜0．05);其中空白对照组心肌匀浆液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α浓度高于正常对照组和CORM干预组，CORM干预组心肌匀浆液IL－1β、IL－ 6、IL－18、TNF－α浓度高于正常对照组，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表3)。

表3 3组小鼠心肌匀浆液炎性递质浓度比较(±s，pg/mg蛋白)Table 3 Comparison of inflammatory mediators levels of myocardial serous in the three groups of rats

表3 3组小鼠心肌匀浆液炎性递质浓度比较(±s，pg/mg蛋白)Table 3 Comparison of inflammatory mediators levels of myocardial serous in the three groups of rats

注:与正常对照组比较，*P＜0．05;与空白对照组比较，△P＜0．05;TNF－α=肿瘤坏死因子α

组别只数IL－1βIL－6IL－18TNF－α 82空白对照组864．15±9．38*145．39±14．12*58．39±8．85*22．57±4．72*CORM干预组1336．39±5．24＊△83．46±9．58＊△34．47±5．12＊△11．34±1．45＊△F正常对照组1521．46±3．5953．17±8．4726．35±4．166．45±0．139．36209．2381．80117．74 P值值0．0000．0000．0000．000

3 讨论

CO是一种气体分子，与血红蛋白结合后可形成碳氧血红蛋白，导致血红蛋白失去携带氧气的能力，因此，长期以来CO一直被视为一种毒性气体。近年研究表明，CO也是机体内一种重要的化学气体信使，具有较强的抗炎、抗凋亡和细胞保护作用［6］。CORM是近年来发现的一种CO复合物，可作为外源性CO供体，其经适当溶剂溶解后能够在生理条件下可控制地释放CO。cTnI属心肌结构蛋白，当心肌细胞遭破坏后可释放入血，是目前已知的反映心肌损伤最为敏感和特异的标志物。本研究结果显示，正常对照组、CORM干预组小鼠病死率低于空白对照组，空白对照组血清cTnI浓度、心肌病变积分高于正常对照组和CORM干预组，CORM干预组血清cTnI浓度、心肌病变积分高于正常对照组，提示CORM可降低VMC小鼠病死率，减轻心肌损伤，具有一定的保护作用。

氧化应激在VMC的发生和发展过程中发挥着重要作用，病毒感染心肌细胞后可造成细胞膜脂质微环境发生紊乱、自由基大量产生及脂质过氧化反应增强，继而造成心肌损伤。MDA是脂质过氧化的终产物，可引起蛋白质、核酸等大分子物质的交联、聚合，具有细胞毒性，可反映机体脂质过氧化程度，从而间接反映细胞损伤情况。SOD、GSH－Px及CAT均为内源性抗氧化酶，是细胞内一线防御系统，主要通过清除过量活性氧抑制自由基损伤［7］。众多研究表明，CORM具有较强的抗脂质过氧化损伤作用［8］。本研究结果显示，空白对照组心肌匀浆液MDA浓度高于正常对照组和CORM干预组，心肌匀浆液SOD、GSH－Px、CAT浓度低于正常对照组和CORM干预组，CORM干预组心肌匀浆液MDA浓度高于正常对照组，心肌匀浆液SOD、GSH－Px、CAT浓度低于正常对照组，提示CORM可增强VMC小鼠体内抗氧化酶活性及其清除氧自由基作用，进而抑制脂质过氧化引起的心肌损伤。

研究表明，机体免疫功能紊乱是VMC的主要发病机制，抗炎治疗与免疫治疗已成为近年来VMC防治研究的热点，IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α等促炎性递质在VMC的发生、发展过程中发挥着重要作用［9］。近年研究发现，CORM具有抗炎和免疫调节作用，已用于多种炎性疾病的治疗。本研究结果显示，空白对照组心肌匀浆液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α浓度高于正常对照组和CORM干预组，CORM干预组心肌匀浆液IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α浓度高于正常对照组，提示CORM可抑制IL－1β、IL－6、IL－18、TNF－α等的产生，继而减轻炎性反应，改善VMC小鼠心功能。抑制炎性反应可能是CORM减轻VMC小鼠心肌损伤的重要作用机制。

综上所述，CORM可降低VMC小鼠病死率及心肌损伤，具有一定的保护作用，其作用机制可能包括抑制脂质过氧化、减轻炎性反应等。本研究为实验研究，为临床治疗VMC提供了实验依据，但其确切作用机制及临床应用效果仍需进一步深入研究。

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ObjectiveTo investigate the protective effect of carbon monoxide releasing molecule(CORM)on viral myocarditis(VMC)mice，and explore its mechanisms．MethodsFifty－five 4－week old male BALB/C mice were randomly divided into normal control group，blank control group and CORM intervention group，each of 15 mice．VMC experimental models were made，and then CORM intervention group given CORM intraperitoneal injection(0．1 ml)，normal control group and blank control group given DMSO intraperitoneal injection(0．1 ml)．Incidence of death was recorded，serum of cardiac troponin I(cTnI)level and myocardial homogenate levels of malondialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione－peroxidase(GSH－Px)，catalase(CAT)，IL－1β，IL－6，IL－18，tumor necrosis factor－α(TNF－α) were detected，myocardial lesions score was calculated．ResultsThe mortality of normal control group and CORM intervention group was lower than that of blank control group，respectively(P＜0．05)．Serum cTnI level，myocardial lesions score of blank control group were higher than those of normal control group and CORM intervention group，and those of CORM intervention group were higher than those of normal control group(P＜0．05)．Myocardial homogenate MDA level of blank control group was higher than that of normal control group and CORM intervention group，respectively，while SOD，GSH－Px，CAT were lower (P＜0．05);myocardial homogenate MDA level of CORM intervention group was higher than that of normal control group，while SOD，GSH－Px，CAT were lower(P＜0．05)．Myocardial homogenate levels of IL－1β，IL－6，IL－18，TNF－α of blankcontrol group were higher than that of normal control group and CORM intervention group，respectively，and those index of CORM intervention group were higher than those of normal control group(P＜0．05)．ConclusionCORM can reduce the mortality and myocardial damage of VMC mice，has certain protective effect;its possible mechanisms including control lipid peroxidation and reduce inflammatory reaction．

Myocarditis;Virus diseases;Carbon monoxide releasing molecule;Oxidative stress;Inflammation; Mice，inbred BALB C

R 542．21

A

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．013

2014－06－15;

2014－12－10)

(本文编辑:鹿飞飞)

衡阳市科技局科研课题(2011KJ42)

421001湖南省衡阳市，南华大学第一附属医院儿科

刘红英．一氧化碳释放分子对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其作用机制研究［J］．实用心脑肺血管病杂志，2015，23(1):41－44．［www．syxnf．net］

Liu HY．Protective effect of carbon monoxide releasing molecule on viral myocarditis mice and its mechanisms［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(1):41－44．

Protective Effect of Carbon Monoxide Releasing Molecule on Viral Myocarditis Mice and Its MechanismsLIU Hong－Ying．Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China