针刺对老年大鼠腹部手术后海马CA1区神经元细胞凋亡的影响※

徐少群 曾素冰 赵高峰 方素娟 黄祥凌 高巨

（广东省中医院麻醉科，广东广州 510120）

术后认知功能障碍（postoperation cognitive dysfunction，POCD）是患者在全麻术后出现的中枢神经系统并发症，常见于接受大手术、急诊手术后的老年患者，表现为手术后数天至数周出现记忆力、精神集中能力、语言理解力受损，社会适应能力下降，甚至可发展为永久性认知障碍，丧失独立生活能力［1］。本课题组前期研究表明，针刺可明显改善老年患者肠癌切除POCD的发生［2］。为进一步探讨针刺对中枢神经的作用机制，我们观察了针刺对老年大鼠腹部手术后海马CA1区神经元凋亡的影响，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物20月龄无特定病原体（SPF）级老年SD大鼠30只，雌雄各半，体质量550～640 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供，动物许可证编号:SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 主要仪器及试剂英迪KWD-808Ⅰ型微电脑脉冲针灸治疗仪（常州英迪电子医疗器械有限公司）;TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒、蛋白酶K（南京建成生物工程研究所）;水合氯醛（美国Sigma公司）;盐酸布比卡因注射液（上海禾丰制药有限公司，国药准字H31022840）;华佗牌15 mm×0.26 mm毫针（苏州医疗用品厂有限公司）;多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司）;Olympus光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组将30只大鼠随机分为5组:空白对照组（以下简称C组）、术后1 d处死组（以下简称S1组）、术后3 d处死组（以下简称S3组）、联合针刺术后1 d后处死组（以下简称A1组）及联合针刺术后3 d处死组（以下简称A3组），每组各6只。

1.2.2 操作方法C组不予任何干预措施;S1组及S3组按照Wan Y等［3］报道方法开腹行脾切除术，具体步骤:予大鼠腹腔内注射10%（W/V）水合氯醛（0.25 mL/100 g）麻醉后，将大鼠固定于手术台，手术切口处备皮、消毒，以0.25%盐酸布比卡因注射液局部浸润麻醉，在上腹部左锁骨中线做1.5 cm小切口，游离出脾脏，结扎脾门神经、血管后，完整切除脾脏，然后用手术缝合线逐层关腹，所有手术步骤均无菌操作。A1组及A3组于麻醉前20 min取百会、印堂行针刺，选用15 mm ×0.26 mm毫针，连接微电脑脉冲针灸治疗仪，采用疏密波，频率2/15 Hz，电针强度为引起局部肌肉微颤动，20 min后进行再行开腹脾切除术操作，电针刺激持续至手术操作完毕。大鼠穴位根据中国针灸学会实验针灸研究会制订的《动物针灸穴位图谱》进行选择。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 标本采集及制作S1组及A1组大鼠于术后1 d腹腔注射10%（W/V）水合氯醛（0.4 mL/kg）过量麻醉，C组、S3组及A3组于术后3d腹腔注射l0%（W/V）水合氯醛（0.4 ml/kg）过量麻醉，然后均经心脏灌注0.9%氯化钠注射液200 mL后，再以4%多聚甲醛300 mL经心脏灌注固定，断头取脑后，分离出大鼠海马组织，放入4%多聚甲醛常规固定24 h后，进行包埋切片。

1.3.2 检测方法采用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒检测海马CA1区神经元凋亡情况。具体步骤如下:按常规方法将石蜡切片进行脱蜡及水合，将处理好的样本浸入磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，每次5 min，然后加入蛋白酶K工作液（2 μL蛋白酶K+98 μL PBS），21～37℃作用15～30 min，再将样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min，处理好样本后浸入封闭液（3%双氧水甲醇溶液）中，室温（15～25℃）封闭10 min后浸入PBS漂洗2次，每次5 min，然后进行标记和显色反应。每张切片在海马CA1区随机选3个视野，于光学显微镜（×200）下摄片，用Image-Pro Plus 6.0软件分析凋亡细胞光密度值。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，行单因素方差分析及LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.15 组大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡检测结果光镜下C组海马CA1区神经元细胞未见明显染色（见封3，图1）;S1组可见大量凋亡细胞体积缩小，凋亡小体呈黑色或紫蓝色位于细胞核内（见封3，图2）;S3组（见封3，图3）及A1组（见封3，图4）亦可见中量呈灰黄色的凋亡细胞; A3组可见少量凋亡细胞（见封3，图5）。

2.25 组大鼠海马CA1区神经元凋亡光密度值比较见表1。

表15 组大鼠海马CA1区神经元凋亡光密度值比较±s

表15 组大鼠海马CA1区神经元凋亡光密度值比较±s

组别n 神经元凋亡光密度值C组0.212±0.068 S1组62.991±0.217 S3组62.182±0.339 A1组61.462±0.175 A3组6 6 0.456±0.073

表1数据经单因素方差分析，与C组比较，S1组、S3组、A1组及A3组海马CA1区神经元凋亡光密度值均明显升高（P＜0.05），且S1组升高最明显（P＜0.05）;与S1组及S3组比较，A1组及A3组海马CA1区神经元凋亡光密度值均明显降低（P＜0.05），且A3组下降最明显（P＜0.05）。

3 讨论

POCD是老年患者手术后常见的神经系统并发症，在非心脏手术后1周内发病率高达25.8%～48.6%［1］。目前，随着社会老龄化的加剧，多数老年人在其余生至少会接受1次手术，而POCD不仅延长患者住院时间，增加术后死亡率，严重危害老年患者术后身心健康恢复，更进一步加重了家庭及社会医疗保障体系的负担。因此，采取积极措施防治POCD有着十分重要的临床和社会意义，并已成为全世界关注的热点课题。但迄今为止，国内外对POCD的研究才刚刚起步，其现代医学发病机制尚不十分清楚，更缺乏有效防治策略［4］。为寻找安全有效的防治方案，本课题根据长期从事围手术期重大疾病防治工作的经验，并结合中医经络学说理论特点，发现针刺在多种缺血缺氧性脑病所致认知功能障碍中具有良好防治效果，并积极开展探索围手术期进行针刺干预对防治POCD的作用，取得了确切疗效［5］。

为进一步探讨针刺中枢神经系统的作用机制，本实验选取了百会及印堂两穴位对老年腹部手术大鼠进行术前干预。针刺百会可调督脉，提升阳气，开窍启闭，醒神安神;印堂虽属经外奇穴，但其位于督脉循行路线之上，故针刺印堂可推动督脉气血运行，可治督脉所过部位病症，有凝神定志、开窍醒神通络的功效。有实验研究表明，督脉电针刺激可改善脑部缺血，直接作用于脑神经，使机体血氧重新分配，以保护脑组织［6］，这种保护机制在于针刺能增加大鼠皮质和海马神经元Bcl -2蛋白表达，降低Bax蛋白表达，抑制神经元凋亡和坏死，保护缺血损伤后的皮质和海马神经元，从而改善大鼠的学习记忆功能［7］。本实验结果也表明，腹部手术可导致大鼠海马CA1区神经元凋亡，并持续至术后3 d仍处于较高水平，但通过术前及术中电针针刺持续干预后，大鼠海马CA1区神经元凋亡水平在术后1 d即明显下降，至术后3 d仅有少量细胞凋亡。

综上所述，手术创伤可引发海马神经元凋亡，针刺可抑制大鼠海马CA1区神经元凋亡，对神经细胞起保护作用，这可能是针刺防治POCD的作用机制之一。

［1］Moller JT.Postoperative cognitive decline:the extent of the problem［J］.Eur J Anaesthesiol，1998，15（6）:765 -767.

［2］林舜艳，尹正录，高巨，等.针刺麻醉对老年患者肠癌切除术后认知功能障碍影响及其S-100β蛋白的变化［J］.中国针灸，2013，33（1）:63-66.

［3］Wan Y，Xu J，Ma D，et al.Postoperative impairment of cognitive function in rats:a possible role for cytokinemediated inflammation in the hippocampus［J］.Anesthesiology，2007，106（3）:436-443.

［4］林舜艳，高巨.老年患者术后认知功能障碍研究新进展［J］.广东医学，2010，31（2）:243-244.

［5］林舜艳，戴载深，高巨，等.老年患者肠癌切除术后早期认知功能障碍的危险因素［J］.中华麻醉学杂志，2011，31（11）:1320-1322.

［6］李真姬，田贵华，黄长军，等.督脉电针对颅脑损伤大鼠48h后差异蛋白组学的机理研究［J］.云南中医中药杂志，2010，31（9）:61-62.

［7］李敏，徐国峰.电针对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和HO-1的影响［J］.中华中医药杂志，2006，21（8）:502-504.

（本文编辑:石康）