鱼类和哺乳类TLR4基因结构和功能的保守与进化

裴永艳黄 容李勇明廖兰杰朱作言汪亚平

(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

鱼类和哺乳类TLR4基因结构和功能的保守与进化

裴永艳1,2黄 容1李勇明1廖兰杰1朱作言1汪亚平1

(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

先天性免疫是生物体第一道免疫防线, 存在于各种多细胞生物中。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是介导机体对病原体相关的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)识别的一类模式识别受体(pattern recognition receptors, PPRs), 在先天性免疫中发挥重要作用。TLR4是toll家族成员之一, 哺乳类中主要负责识别细菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)。文章就TLR4的发现历史, TLR4在鱼类和哺乳类中的结构特点, TLR4的分布特征, 鱼类和哺乳类中TLR4识别配体的差异, TLR4的信号传导以及TLR4的进化进行了综述。综述将对TLR相关研究提供借鉴和参考。

TLR4; 信号通路; 脂多糖; 进化

生物体每时每刻都受到各种病原微生物的感染,在一般情况下生物体的免疫系统可以发挥作用清除这些病原微生物。生物的免疫系统包括两种类型,即先天性免疫和获得性免疫。先天性免疫是生物体第一道免疫防线, 存在于各种多细胞生物中[1]。当病原体侵入生物体后, 先天性免疫系统可以通过多种模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)识别病原体的一些非特异性的、高度保守且对生存和致病性必要的分子结构, 比如内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、未甲基化的多聚CpG核苷酸、鞭毛、双链RNA和肽聚糖等。这种来自细菌或病毒的特定的结构被称为病原体相关的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)[2—4]。然后, 生物体产生迅速有效的免疫反应, 清除病原体, 同时也会导致炎症反应的发生。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是介导机体对PAMPs识别的一类PRRs, 在先天性免疫中发挥了重要的作用[5,6]。Toll样受体最先在果蝇中被发现, 并且在果蝇早期胚胎的背腹极性的形成中起重要作用[7]。不同的生物中至少存在15种TLRs, 包括TLR1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11/12、13、14、21和TLR22/23[7]。其中, 人类的 TLR4是哺乳动物中第一个被鉴定的TLR受体, 同时是果蝇TLR1的直系同源基因[8]。在哺乳动物中, TLR4是LPS主要识别受体, 在机体炎症反应的信号传导中发挥了重要作用。TLR4是研究较为深入的TLR家族成员。本文就其从哺乳类TLR4到鱼类TLR4发现历史及结构特点、TLR4的配体识别及信号通路和 TLR4的功能进化研究等方面综述如下。

1 TLR4的发现

1980年, Nusslein-Volhard等首先命名了Toll基因[9], 1984年Steward等研究黑腹果蝇胚胎极性形成时发现一种Toll蛋白能够影响背腹轴极性的形成[10], 1985年, Anderson等在果蝇中克隆了Toll基因[11]。1991年, Gay等发现, Toll蛋白在结构上与哺乳动物中一种天然免疫功能分子—白细胞介素受体(Interleukon-1, IL-1)具有同源性, 二者的胞内区部分结构上相似[12], 暗示了 Toll可能和免疫有关。1994年, Nomura等报道了人类的第一个 TLR[13]。1996年, Taguchi等将其定位在 4号染色体上[14]。Lemaitre等发现果蝇中的Toll在抗真菌免疫反应中发挥重要作用, 它能促进抗菌肽的合成[15]。1997年, Medzhitov等首次发现与果蝇Toll蛋白同源的人Toll蛋白基因及其编码的 Toll样受体蛋白, 即如今的TLR4蛋白。TLR4与配体结合后, 能诱导一些关键基因的表达, 从而激活获得性免疫反应[8]。对TLR4突变和缺失的小鼠研究发现TLR4是LPS的主要识别受体[16—18]。Leveque等克隆了鸡的TLR4, 发现其对沙门氏菌有抵制作用[19]。研究发现斑马鱼13号染色体上存在3个TLR4同源基因[20—22]。Huang等发现草鱼中存在一个TLR4基因簇, 其包含4个TLR4基因, 它们对 LPS没有明显的响应而对病毒具有一定程度的响应[23]。

2 TLR4在不同物种中的结构特点

TLRs家族为I型跨膜蛋白, 家族中各个成员的蛋白结构基本相似, 均包括 3个主要结构域: (1)胞外区, (2)跨膜区, (3)胞内 Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR)。胞外区由 19—25个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich repeat, LRR)组成, 每个 LRR有 24—29个氨基酸,包含一个保守的 XLXXLXLXX模块和一个保守的XØXXØXXXXFXXLX模块(X为任意氨基酸, Ø为疏水性氨基酸), 折叠形成马蹄形结构。同时, 这个区包含一个配体结合区域(Ligand Binding Region, LBR)可以直接识别PAMPs。该区域受到进化的选择,具有较大的变异性, 从而适应不同的配体分子[24]。胞内TIR结构域序列与白细胞介素1受体1L-1R家族的胞质区序列有高度同源性, 两者的分子构象也很相似[25,26], TIR结构域高度保守, 功能是信号传导[27]。

TLR4在哺乳动物中同样具有这三个结构域,然而在鱼类中却发生了变化。在草鱼中, 存在的 4个 TLR4s(CiTLR4.1、 CiTLR4.2、CiTLR4.3、CiTLR4.4), 其中 CiTLR4.2、CiTLR4.3、CiTLR4.4是典型的TLRs, 包含 LRR结构域、跨膜区和TIR结构域。但是, 与这3个基因相比, CiTLR4.1的DNA序列有207 bp的缺失, 导致翻译的蛋白只有LRR结构域, 没有跨膜区和胞内 TIR结构域。此外几乎所有的哺乳类和鸟类的TLRs都有完整的信号肽区域,然而斑马鱼和草鱼的TLR4s则有所不同。斑马鱼的DrTLR4ba1以及草鱼的 CiTLR4.1、CiTLR4.2没有信号肽序列[23]。

3 TLR4的分布特征

TLRs家族广泛分布于各种免疫细胞中, 包括巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞、特定类型的T淋巴细胞, 此外还分布在一些非免疫细胞中如上表皮细胞及成纤维细胞中。TLR4同样存在于各种免疫细胞中, 在部分组织细胞如人角膜上皮细胞中也有表达[28,29]。斑马鱼的 3个 TLR4基因中, 有两个(DrTLR4ba1、DrTLR4bb)表达模式已报道过, DrTLR4ba1在血液、肠、精巢、皮肤、脑、肝脏、心脏中均有表达, 而 DrTLR4bb仅仅在皮肤和心脏中表达[20]。草鱼中四个 TLR4s分布于多个组织中,如脑、心脏、肌肉、肝脏、肾脏等[23]。

4 TLR4的配体识别差异

在TLRs家族中, 根据识别的配体不同将TLRs分为两个亚类, 第一个亚类包括TLR1、2、4、5、6和TLR10, 这些TLRs存在于细胞膜的表面, 主要结合细菌表面的PAMPs, 如肽聚糖、脂多糖和鞭毛等,它们被称作识别细菌的 TLRs[30—36]。第二个亚类包括TLR3、7、8和TLR9, 它们存在于细胞内体上, 主要识别病毒相关的PAMPs, 如未甲基化的多聚CpG核苷酸、双链 RNA等, 它们被称作识别病毒的TLRs[30—36]。

在哺乳动物中TLR4识别的配体包括外源性配体如LPS和由于细胞损伤生成的内源性物质如高迁移率族蛋白 B1(High mobility group protein B1, HMGB1)、透明质酸和二聚糖等[37,38]。LPS是G-细菌细胞壁主要成分, 结构上由类脂 A、核心多糖和O-特异侧链3部分组成。类脂A主要激活哺乳动物先天性免疫反应及赋予LPS内毒素毒性[39]。此外, 在鱼类中有些种类的LPS对机体起到免疫保护作用[40]。

由于TLR2和TLR4在对LPS响应的细胞中如外周血白细胞, 巨噬细胞和单核细胞的高度表达, TLR2一度被认为是识别LPS的主要受体[41]。后经研究发现 TLR4才是 LPS主要识别受体。Poltorak等报道了LPS耐受的C3H/HeJ小鼠是由于TLR4基因突变引起的; LPS耐受的C57BL/10ScCr小鼠中不存在TLR4mRNA的表达[16]。Hoshino等发现TLR4缺陷的小鼠对LPS没有反应[18]。此外, Kawata等发现一种脂多糖抑制剂阻止外源导入 TLR4的细胞对LPS的响应[42]。Chow等通过NF-кB双荧光素酶报告系统指出TLR4介导了LPS的信号传导[17]。

TLR4不能像大部分TLRs那样能够直接识别相应配体[43,44]。在哺乳动物中, TLR4识别 LPS需要LBP、CD14和MD-2的辅助。LBP是一种可溶性的蛋白, 能直接结合LPS, 从而促进LPS与CD14的结合。CD14是糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白, 也可以以可溶性的形式存在, 它的功能是把 LPS转移给TLR4/MD-2受体复合物[45]。LPS与TLR4相互作用之前需要先结合辅助受体MD-2, 即LPS结合MD-2的疏水区, 诱导TLR4/MD-2二聚化, 最终激活信号通路[43,44]。MD-2是可溶性的糖蛋白, 与TLR4非共价结合, 它还具有单独同LPS结合的能力[45]。总而言之, LBP与LPS结合, 并将其运输到细胞表面, 与CD14形成三元复合物, 然后将 LPS传递给 TLR4/ MD-2受体复合物从而诱导下游的信号通路[46]。TLR4不能直接与LPS接合, 必须依赖于MD-2。

较低等的脊椎动物特别是鱼类和两栖类对 LPS的毒性反应有耐受力[47]。相对于哺乳动物而言, 在体外实验中需要使用极高浓度的LPS刺激不同鱼类的白细胞才能达到预期的效果[48—52]。用LPS刺激斑马鱼, 其TLR4基因的表达没有响应, 推测斑马鱼体内识别LPS不是通过TLR4介导的。另外, 斑马鱼的TLR4s对热灭活大肠埃希氏菌和热灭活的嗜肺军团菌也没有响应。然而将斑马鱼 TLR4的跨膜区及胞内区融合到小鼠TLR4的胞外区后的嵌合分子可以激活NF-кB的反应, 证明斑马鱼TLR4缺乏识别LPS的能力是由于斑马鱼 TLR4s胞外区没有识别LPS的能力, 而不是由于其 TIR结构域转导信号能力的改变。这同时反驳了之前报道的斑马鱼 TLR4s的 TIR区负调节 NF-кB的说法, 证实了鱼类中的TLR4与LPS的识别无关并且可能存在另一种LPS识别途径的假说[53]。后来研究发现斑马鱼对LPS具有耐受性, 可能由于斑马鱼 TLR4信号传导中MyD88上游的接头分子TIRAP蛋白N端比哺乳动物多了 105个氨基酸的原因[54]。然而, 在河豚中的研究显示了清道夫受体SR代替了TLR4识别LPS,同时参与NF-κB的负调节, 鱼类中是否普遍存在这样的现象, 有待深入研究[55]。

哺乳动物的呼吸道合胞体病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)的融合蛋白和LPS一样, 能通过TLR4途径激活细胞免疫反应[56,57]。小鼠乳腺肿瘤病毒(Mouse mammary tumor virus, MMTV)则能与小鼠TLR4免疫共沉淀, 它们的结合能激活B细胞免疫反应[58]。

用草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)攻毒处理稀有鲫 36h后, 稀有鲫 TLR4b基因mRNA表达水平上调了5倍[59]。GCRV感染草鱼后, CiTLR4.3和CiTLR4.4在肝脏和肌肉中的表达量都逐渐增加, 并且4个TLR4基因mRNA表达水平都有明显上调的趋势[23]。以上结果暗示了TLR4在鱼类中可能与病毒的识别相关。

5 TLR4的信号传导

TLRs识别受体后并与之结合, 同时自身二聚化, 并通过其胞内TIR结构域募集其他含TIR结构域的接头分子, 如 MyD88、TIRAP(也称为 Mal)、TRIF(也称为TICAM1)和TRAM(也称为TICAM2)。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLR11能够募集MyD88。除了募集MyD88外, TLR1、TLR2、TLR4和TLR6还能够募集TIRAP, TIRAP的功能是介导TLRs与MyD88的连接。TLR3和 TLR4能够募集 TRIF, 另外, TLR4还能够集TRAM, TRAM的功能是介导TLR4与TRIF的连接[60]。上述的这些募集分子归到两条信号通路中, 一条信号通路是依赖MyD88的信号通路, 即依赖于MyD88和TIRAP诱导炎症反应因子IL-1和TNFα的表达[61,62]。另一条是非依赖于 MyD88的信号通路, 即依赖于TRIF和TRAM来激活NF-кB和抗病毒的I型IFN的反应[62,63]。在TLRs家族中, 大部分TLRs成员是依赖于MyD88的信号通路, 而TLR3只有非依赖于MyD88的信号通路, TLR4是唯一拥有两条信号通路的TLRs成员[63,64]。

在哺乳动物中, 对于依赖于MyD88的途径, 当LPS的信号作用于TLR4时, TLR4的胞内区与一个接头分子MyD88的同源结构域相结合。MyD88包含两个结构域, 与 Toll受体同源结构域结合的羧基末端和包含死亡结构域的氨基末端[63—65]。该死亡结构域与白细胞介素-1受体相关激酶 4(IL-1 receptor-associated kinase, IRAK)的死亡结构域相互作用引起 IRAK4磷酸化下游的激酶 IRAK1。磷酸化的IRAK1募集并激活肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TNF-receptor-associated factor 6,TRAF-6)[66]。这一因子反过来又结合并激活 TAB1/TAK1/TAB2复合物。TAK1磷酸化NF-кB抑制剂(IкB)的激酶(IKK),然后活化的IKK再磷酸化IкB, 最终导致IкB泛素化而降解[67], 从而使NF-кB从抑制状态下被激活。细胞质中游离的NF-кB转位到细胞核, 其活性二聚体启动细胞因子如 IL-1的转录。对于非依赖于MyD88的途径, 当 LPS的信号作用于 TLR4时, TLR4募集TRIF、TRAM两个接头分子, TBK1磷酸化 IKK, 激活干扰素调节因子 IRF3, 使其二聚化并移位到细胞核, 诱导I型IFN, IFN-β的表达[64,68—70]。总之, TLR4信号级联反应主要激活转录因子NF-кB、IRF3等, 最后诱导免疫相关基因的转录和表达(图1)。

图1 哺乳动物中TLR4信号通路Fig. 1 TLR4signal transduction pathway

6 TLR4的功能进化研究

虽然之前认为脊椎动物TLRs在进化上很保守[31],然而一些物种如鸟类和鱼类中的 TLRs并不如预期的保守, 它们经历了一定的进化上的正向选择[71,72]。一般情况下, TLRs的LRR区比TIR区进化速率要快。在TLRs家族中, TLR3和TLR7的LRR区进化速率最低, 它们可能代表了先天性免疫系统中一种保守的机制和结构。然而, 在TLR10中, LRR区进化速率却低于 TIR区, 这说明它的信号传导功能可能不同于其他TLRs[73]。此外, 啮齿目TLR4和TLR7经历了正向选择, 并且TLR4比TLR7的进化速度要快, TLR4的胞外区的LBR具有可变性, 这与其识别的配体种类的多样性有关[74]。

TLRs家族的成员随着脊椎动物的产生而不断增加, 然而多样性随着脊椎动物免疫系统的完善而逐渐降低。线虫中有 1个 TLR[75], 海葵中有 1个TLRs[76], 海胆中有 2个 TLRs[77], 海鞘中有 3个TLRs[78], 而作为圆口类七鳃鳗的 TLRs成员却高达16个[79]。硬骨鱼类的TLRs则具有更高的多态性, 硬骨鱼中总共发现18种类型的TLRs(TLR1、2、3、4、5、7、8、9、14、16、18、19、20、21、22、23、25、26)[80]。鱼类中的TLRs还存在旁系同源基因, 如斑马鱼共有21个TLRs成员, 其中的TLR4有3个旁系同源基因, TLR5有2个, TLR8有2个, TLR20有 6个[21], 其他鱼类中也有相类似的报道。而在人和小鼠中仅发现了13个TLRs[31]。以上现象说明随着获得性免疫系统的不断完善并在免疫系统中逐渐占据核心地位, 作为模式识别受体的 TLRs因为功能上的冗余而逐渐丢失。

脊椎动物的TLRs主要分为14个分支, 各个物种拥有的不同的TLRs分支, 但每种TLRs分支只有一个拷贝[7]。TLR4在人和小鼠中只有一个拷贝。然而鱼类中 TLR4的现象比较复杂, 在稀有鲫中现已报道了一个 TLR4[59], 斑点叉尾中存在两个TLR4(TLR4/TLR4S)[80], 在斑马鱼基因组中却发现了三个TLR4(DrTLR4ba1、DrTLR4ba2和DrTLR4bb),草鱼基因组中存在4个TLR4(CiTLR4.1、CiTLR4.2、CiTLR4.3和CiTLR4.4)[23]。在河豚、东方红鳍豚、淡水豚和刺鱼基因组中却没检测到TLR4[81,82]。以上现象都说明了鱼类TLR4基因在进化上非常活跃[23]。共线性和进化树分析显示斑马鱼的 TLR4与人的TLR4是旁系同源, 而非直系同源[81], 这说明鱼类和哺乳动物分支后, TLR4发生了变化。系统进化分析表明, 斑马鱼TLR4s与小鼠、人和鸡TLR4s聚为一支而与其他TLR4s分开。草鱼和斑马鱼的TLR4s首先聚在一起, 再与哺乳类、鸟类的TLR4s聚在一起[23]。斑马鱼和草鱼共同的祖先很可能是2个TLR4基因, 其中一个分化成斑马鱼的 DrTLR4bb和草鱼的CiTLR4.4, 另一个则通过1次复制分化成斑马鱼的DrTLR4ba和LOC795671, 通过2次复制分化成草鱼的CiTLR4.1、CiTLR4.2、CiTLR4.3[23]。研究显示河豚中的TLR4基因的丢失是由于清道夫受体SR代替了TLR4基因识别LPS[55]。斑马鱼基因组TLR4基因的保留可能是由于通过TLR4或其他TLR的亚功能化和新功能化使得 TLR4基因的存在是不可或缺的[22]。

斑马鱼TLR4对LPS的刺激没有反应, Sepulcre等基于双荧光素酶报告系统分析斑马鱼的整个胚胎,指出了TLR4在LPS信号传导中作用的另一种观点: TLR4负调控MyD88依赖性的TLR途径[83]。后来研究反驳了这个观点并证实斑马鱼TLR4缺乏识别LPS的能力是由于斑马鱼 TLR4s胞外区没有识别LPS的能力[82]。较低等的脊椎动物特别是鱼类和两栖类对LPS的毒性反应有耐受力[47]。相对于哺乳动物而言, 在体外实验中需要使用极高浓度的LPS刺激不同鱼类的白细胞才能达到预期的效果[48—52],似乎只有高等的脊椎动物对低剂量的LPS才有典型的TLR4依赖的免疫反应[84]。这支持了TLR4识别LPS发生在鱼类和四足动物分支之后这个假说[83]。

7 小结与展望

在哺乳动物特别是人类中, 由于 TLR4可以识别LPS, 参与LPS诱导的炎症反应并和许多疾病如肿瘤、动脉粥样硬化及哮喘关系密切, 有关 TLR4的功能研究的很透彻。然而, 由于鱼类中 TLR4发现比较晚, 存在TLR4的物种也比较少, 所以TLR4的功能目前还不是很确定。

在哺乳动物中TLR4是LPS的主要受体, 可以通过CD14和MD-2的协同作用介导LPS诱导的炎症反应[45,46]。TLR4或MD-2缺失的小鼠巨噬细胞对LPS的刺激无响应, TLR4/MD-2复合物是识别LPS的唯一受体[85]。在鱼类中发现LPS并没有诱导TLR4的高表达, 鱼类现有的基因组类和EST序列中均不存在CD14和MD-2[22,84]。这说明鱼中TLR4可能无法识别LPS或依赖于另一种受体识别LPS。在草鱼和稀有鲫中, 发现病毒诱导了 TLR4的表达[23,59],这说明在鱼类中TLR4的功能可能是识别病毒而不是 LPS, 其识别的配体还需要进一步的研究验证。TLR4对LPS的识别可能是在鱼类和四足动物分支以后形成的。此外, 鱼类与哺乳动物的 TLR4结构也存在差异。鱼类中不同TLR4拷贝的功能比较研究也将为其他TLR在物种进化过程中的功能进化研究提供更多线索。

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CONSERVATIVE AND EVOLUTION OF TLR4’S GENE STRUCTURE AND FUNCTION IN FISH AND MAMMALIAN

PEI Yong-Yan1,2, HUANG Rong1, LI Yong-Ming1, LIAO Lan-Jie1, ZHU Zuo-Yan1and WANG Ya-Ping1
(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Innate immunity is the first defense of organisms, which exist in all kinds of multicellular organism. Toll-like receptors (TLRs) is aclass of Pattern recognition receptors (PRRs) that involved in the recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and played an important role in innate immunity. In regard to TLR4, which is a member of TLRs and could recognize the lipopolysaccharide (LPS) in bacterial. In the study, the found history of TLR4, structural features of TLR4 in mammalians and fish, distribution of TLR4, difference of TLR4 in mammalians and fish, signaling transmission, and the evolution of TLR4 were reviewed. This summary in the study would provide a reference for the research of TLR.

TLR4; Signal transduction pathway; LPS; Evolution

Q342+.4

A

1000-3207(2015)03-0590-08

10.7541/2015.77

2014-01-24;

2014-12-07

国家自然科学基金(31130055, 31123001)资助

裴永艳(1989—), 女, 江苏省宿迁人; 博士; 主要从事鱼类抗病基因的功能研究。E-mail: callmepyy@126.com

汪亚平(1963—), 男, 研究员; 研究方向为鱼类功能基因组学、鱼类分子育种等。E-mail: wangyp@ihb.ac.cn