以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组疫苗的构建

唐冬梅，付丽新，周　彪，郭政宏，严亨秀（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）



以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组疫苗的构建

唐冬梅，付丽新，周彪，郭政宏，严亨秀＊
（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

摘 要：构建以多层纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒基因重组疫苗。在GenBank中查询编码O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1 141-160氨基酸和VP2 1-33氨基酸的核苷酸序列，合成该两段基因的重组基因并命名为VP1-VP2基因。再通过PCR扩增VP1和VP2基因，并将VP1、VP2及VP1-VP2基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1中，构建3种重组真核表达质粒（pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA 3.1-VP1-VP2），并分别对重组质粒进行酶切、PCR鉴定及测序分析。将构建的重组质粒制备成多层磷酸钙纳米颗粒，检测其粒径、稳定性及体外转染效率。重组质粒酶切结果显示，基因片段大小与预期相符；测序显示与GenBank中相应基因序列同源性为100%。制备的多层纳米颗粒粒径约为530nm；在4℃过夜保存后，溶液均匀透明；体外转染HEK293细胞的转染效率在9.6%左右。成功构建了以多层磷酸钙纳米颗粒为载体的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重组质粒，为进一步研究该基因疫苗奠定了基础。

关键词：口蹄疫；多层纳米颗粒；VP1基因；VP2基因；磷酸钙；基因疫苗

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）感染偶蹄动物和人所引起的一种急性、高接触性的人畜共患传染病［1］。我国将其列为一类动物传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病［2-3］。口蹄疫病毒属小RNA病毒科口蹄疫病毒属［4-5］，其抗原位点由4种结构蛋白构成，分别为VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1是唯一能够产生保护性中和抗体的重要结构蛋白［6-7］。有研究发现O型FMDV VP1的141-160氨基酸序列具有很好的免疫原性［8］。Fan H等［9］发现，当把猪或鼠的C3d基因与VP1基因偶连后能显著提高VP1 DNA疫苗在豚鼠中的免疫反应，这也显示将C3d-VP1的嵌合体作为抗FMDV的新型疫苗具有很好的潜力。目前，对于O型FMDV结构蛋白的研究主要集中在VP1结构蛋白上，而对VP2结构蛋白的研究报道很少。研究发现，在A型口蹄疫病毒中，VP2的1-33aa可提高VP1肽段的免疫原性，但对于O型口蹄疫中VP2肽段能否增强VP1肽段的免疫原性还未见报道［10］。

当前各国对口蹄疫的防控普遍采用疫苗接种。常规的口蹄疫疫苗包括灭活疫苗、多肽疫苗和弱毒疫苗等。但是这些疫苗存在免疫原性差、保护能力低、潜在安全风险等缺点。因此，研制高效安全的疫苗已成为口蹄疫防控领域的热点。其中基因疫苗作为一种新型疫苗受到了高度关注。如何采用安全有效的载体将外源基因转到受体细胞内是基因疫苗发挥效应的关键［11-12］。现在普遍采用的DNA转染系统包括非病毒载体介导和病毒载体介导，常见的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒等。病毒作为载体转染效率高，但安全性低。因此，非病毒载体获得了广泛关注，其中磷酸钙纳米颗粒更成为研究的热点。Chowdhury E H等［13］通过构建用细胞外基质蛋白包裹的DNA与磷酸钙的复合物，实现了基因在哺乳动物细胞中的高效率表达。目前，研究中通常使用单层磷酸钙纳米颗粒作为转染载体，通过加入钙离子、磷酸根离子在DNA表面结合形成单层磷酸钙结晶，从而对DNA形成保护，使其转入机体后不容易被酶类降解掉［14］。Sokolova V V等［15］将DNA与磷酸钙颗粒多次结合形成多层纳米颗粒，在体外获得了较好的转染效率。在这些研究基础上，本试验尝试将多层磷酸钙纳米作为FMDV抗原基因的载体，将O型口蹄疫病毒的VP1 141-160aa序列和VP2 1-33aa序列的核苷酸片段进行合成，并插入到pUC57表达载体中，获得重组质粒pUC57-VP1-VP2。将VP1-VP2从测序正确的上述重组质粒中酶切下来，插入到真核表达载体pcDNA3.1中，构建成重组质粒pcDNA3.1-VP1-VP2。再采用PCR分别扩增VP1、VP2，插入到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3. 1-VP1和pcDNA3.1-VP2。将3种重组质粒用磷酸钙包裹成多层磷酸钙纳米颗粒，并检测该颗粒的粒径大小、稳定性；将质粒pcDNA3.1-GFP裹成多层磷酸钙纳米颗粒，以检测此种纳米颗粒的细胞转染效率。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、DNA连接酶为Fermentas公司产品；琼脂糖干粉为Invitrogen公司产品；蛋白胨、酵母粉为OXOID公司产品；PCR试剂盒为TaKaRa公司产品；磷酸氢二铵、硝酸钙、氢氧化钠为成都科龙化学试剂厂产品；感受态细胞DH5α、DNA胶回收试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒为天根生化科技有限公司产品；胎牛血清（FBS）、胰酶和DMEM培养基为Gibco公司产品；质粒pcDNA3.1-GFP、HEK293细胞由四川大学生物治疗国家重点实验室惠赠。

1.1.2仪器设备 PCR仪为Eppendorf公司产品；分光光度计为美国Varian公司产品；凝胶成像系统为BioRAD公司产品；pH计为METTER TOLEDO公司产品；粒度仪为英国马尔文公司产品；荧光倒置显微镜为ZEISS公司产品。

1.2方法

1.2.1O型口蹄疫病毒VP1与VP2基因的化学合成 在GenBank中（AF308157.1）查询猪O型口蹄疫病毒的VP1的141-160aa序列和VP2 1-33aa序列的核苷酸片段，然后将两段基因重组并命名为VP1-VP2基因。设计核苷酸序列（图1），将该序列委托金唯智公司合成，并重组到pUC57质粒中并命名为pUC57-VP1-VP2，交由美吉公司测序鉴定。

图1　重组基因的核苷酸序列Fig.1 The nucleotide sequence of recombinant gene

1.2.2真核表达载体pcDNA3.1-VP1-VP2的构建在5mL含Amp的LB培养基中加入20μL测序验证的pUC57-VP1-VP2菌液，置于37℃振荡培养箱中培养过夜。次日，按质粒提取试剂盒说明书中的方法小量抽提质粒pUC57-VP1-VP2。利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对质粒pUC57-VP1-VP2酶切；用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对质粒pcDNA3.1酶切。分别以10g/L琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收纯化。用DNA连接酶连接目的基因和表达载体，然后进行转化，挑菌和提取质粒，得到重组真核表达质粒pcDNA3.1-VP1-VP2。利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对其酶切，酶切产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒交由美吉公司测序鉴定。

1.2.3真核表达载体pcDNA3.1-VP1和pcDNA3. 1-VP2构建 用软件Primer 5.0设计引物。VP1引物序列如下：上游5′-TAGAATTCGGCACCATGACTAACAACGTGAGAGG-3′，下游：5′-GGGCTCGAGTTAGGGCAGAGTTCTTTC-3′。VP2引物序列如下：上游：5′-GGGGAATTCGCCACCATGGA-3′，下游：5′-ATCTCGAGTCAAGTCACCCCGACGCTA-3′。在上、下游分别引入EcoRⅠ酶切位点和XhoⅠ酶切位点（下划线部分），并委托金唯智生物公司合成。分别PCR扩增VP1 141-160氨基酸序列的核苷酸片段和VP2 1-33氨基酸序列的的核苷酸片段。PCR扩增反应体系为50μL：其中ddH2O 34.75μL，25 mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP mix 4μL，10×PCR buffer 5μL，Taq polymerase 0.25μL，上下游引物各1μL，取1μL质粒pUC57-VP1-VP2作为模板。PCR扩增条件：95℃3 min；95℃0.5 min，VP1 64℃0.5min，VP2 65℃0.5min，72℃20s，30个循环；72℃10min，最后于12℃终止反应。扩增产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳分离并胶回收纯化。用限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ分别对VP1基因、VP2基因和质粒pcDNA3.1双酶切，酶切产物电泳后进行胶回收纯化。用DNA连接酶连接目的基因和表达载体，然后进行转化，挑菌和提取质粒，得到重组真核表达质粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2。然后利用酶EcoRⅠ和XhoⅠ对pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2分别进行酶切，再将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。对上述重组质粒进行PCR鉴定。将酶切鉴定正确的重组质粒交由美吉公司测序鉴定。

1.2.4多层纳米颗粒制备 参照文献［15］，制备多层纳米颗粒（图2）。配制18mmol/L Ca（NO3）2溶液，10.8mmol/L（NH4）2HPO4溶液，用0.1mmol/ L NaOH溶液将pH均调为9。所有溶液过滤除菌。在无菌玻璃圆底烧瓶中加入Ca（NO3）2和（NH4）2HPO4预混30s，取50μL混合液与10μg DNA混合，制成负载DNA的磷酸钙纳米颗粒溶液，进行磁力搅拌，逐滴加入25μL Ca（NO3）2溶液，随后再逐滴加入25μL（NH4）2HPO4溶液，从而在上述颗粒表面形成磷酸钙结晶。再次加入10μg质粒DNA混合，磁力搅拌3h，形成多层磷酸钙纳米颗粒。

图2　多层纳米颗粒的结构示意图Fig.2 Schematic representation of multi-shell calcium phosphate/DNA nanoparticles

1.2.5多层纳米颗粒粒径和稳定性检测 将3种已构建成功的真核表达载体（pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP1-VP2）按上述方法制备成多层磷酸钙纳米颗粒。用粒度仪检测其粒径大小。观察溶液颜色、气味、浊度、沉淀物等物理特性，再通过于4℃静置过夜后溶液的变化检测其稳定性。试验重复3次。

1.2.6多层纳米颗粒体外转染细胞 用胰酶消化HEK293细胞，铺于24孔板中，每孔细胞数为2×104个。将pcDNA3.1-GFP按2.4所述方法包裹成多层磷酸钙纳米颗粒。按文献［16］方法，将包裹完成的多层纳米颗粒按每孔2μg DNA的量加入到细胞中，同时加500μL含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基。设立阴性对照组，对照组每孔加入2μg没有包裹成纳米颗粒的裸露质粒pcDNA3.1-GFP，加入500μL培养基。12h后，更换新培养基；转染48h后，用荧光倒置显微镜观测转染效率。每组细胞镜下随机选取5个视野，记录每个视野的转染效率并统计。

2　结果

2.1重组质粒pUC57-VP1-VP2的构建与测序分析

将VP1 141-160aa和VP2 1-33aa的核苷酸序列重组，构建质粒pUC57-VP1-VP2，并对其测序鉴定。测序结果用Blast软件比对，结果显示质粒pUC57-VP1-VP2中合成的VP1基因序列（VP1）与在GenBank上已发表的猪O型口蹄疫病毒株（DQ248888.1）的目的核苷酸序列同源性为100%；合成的VP2基因序列（VP2）与在GenBank上已发表的猪O型口蹄疫病毒株（AF308157.1）的目的核苷酸序列同源性为100%（图3）。

图3　重组质粒中VP1和VP2基因序列Blast比对结果Fig.3 The result of Blast about VP1and VP2gene sequences

2.2重组质粒pcDNA3.1-VP1-VP2酶切分析鉴定

利用酶EcoRⅠ、XhoⅠ对已经测序鉴定正确的重组质粒pUC57-VP1-VP2酶切，回收酶切产物后，插入质粒pcDNA3.1构建重组质粒pcDNA3.1-VP1-VP2。利用酶EcoRⅠ和XhoⅠ对pcDNA3.1-VP1-VP2进行双酶切后电泳鉴定。从电泳中获得228bp的DNA片段，与目的基因片段VP1-VP2 （228bp）大小相符（图4）。这表明VP1-VP2基因片段已被成功重组到该真核表达载体pcDNA3.1中。

2.3重组质粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2的酶切分析和PCR鉴定

重组质粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2经酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，得到大小约为84 bp或123bp DNA片段，与预期结果相符（图5）。对这两种进行PCR鉴定，获得大小约为84bp或123bp片段，与预期结果相符（图6）。说明VP1与VP2成功插入到真核表达载体pcDNA3.1中。

图4　酶切鉴定重组质粒pcDNA3.1-VP1-VP2Fig.4 Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-VP1-VP2by enzyme digestion

图5　重组质粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2的酶切分析Fig.5 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1-VP1 and pcDNA3.1-VP2by enzyme digestion

图6　重组质粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2 PCR鉴定Fig.6 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1-VP1 and pcDNA3.1-VP2by PCR

2.4重组质粒测序分析

取经酶切正确的质粒pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2及pcDNA3.1-VP1-VP2送公司测序鉴定，所得基因序列经Blast软件比对。结果显示，重组质粒中VP1基因序列与在GenBank上已发表的猪O型口蹄疫病毒株（DQ248888.1）的目的核苷酸序列同源性为100%；重组质粒中VP2基因序列与在GenBank上已发表的猪O型口蹄疫病毒株（AF308157.1）的目的核苷酸序列同源性为100%。序列比对结果与图3所示相同。

2.5多层纳米颗粒的制备及粒径和稳定性检测

将构建成功的真核表达载体pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP1-VP2制备成多层磷酸钙纳米颗粒复合体。该复合体无色无气味，无沉淀且均匀透明。该多层磷酸钙纳米颗粒复合体置于4℃过夜后，复合体均匀透明，无沉淀生成。用马尔文纳米粒度仪检测该纳米颗粒粒径，检测结果显示制备的多层磷酸钙纳米颗粒粒径在530nm左右。2.6 多层磷酸钙纳米颗粒的转染效率

将质粒pcDNA3.1-GFP包裹成多层磷酸钙纳米颗粒，转染HEK 293细胞48h后，在荧光显微镜下检测转染效率。其转染效率约为9.60%± 0.58%；而用裸露的荧光质粒转染细胞，镜下仅观察到少量荧光，转染率在2.00%±0.70%左右，见图7。结果显示，多层磷酸钙纳米颗粒载体可携带DNA进入细胞。

3　讨论

口蹄疫作为危害畜牧业的重大传染病，各国都在加强对其的研究力度，尤其新型基因疫苗的研发备受关注。在对FMDV的研究中发现，O型口蹄疫病毒VP1的141-160位氨基酸所处的G-H环是重要的保护性抗原位点［17］。也有研究发现，在A型口蹄疫病毒中VP2 1-33位氨基酸能够增强VP1肽段的免疫原性［8］。但在O型口蹄疫免疫治疗中，VP2能否增强VP1的免疫原性，还未见报道。

Graham F L等［18］在早期研究中发现磷酸钙可作为载体将外源DNA转入细胞。一定浓度的氯化钙与DNA结合后，在电荷作用下可与磷酸根离子在DNA表面形成磷酸钙结晶，从而包裹DNA，形成纳米颗粒。细胞通过内吞作用将磷酸钙纳米颗粒摄取进入细胞，细胞内的囊泡将其摄取并与溶酶体融合，再将磷酸钙-DNA复合体释放到细胞质内。DNA以这种方式负载进入体内后，可以大大降低DNA在细胞内的降解率［19］。Sokolova V V等［15］发现将钙离子、磷酸根离子与DNA制成多层磷酸钙颗粒后，可提高体外细胞转染效率。

图7　质粒pcDNA3.1-GFP转染HEK293细胞Fig.7 HEK293cells transfected with multi-shell CaPi-pcDNA3.1-GFP DNA

本研究将O型FMDV的VP1 141-160aa的核苷酸序列和VP2 1-33aa的核苷酸序列进行成功重组，并利用质粒pcDNA3.1构建3种真核表达载体pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP1-VP2。对3种质粒进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定发现酶切所获的DNA片段与目的基因大小一致。再将酶切鉴定正确的质粒进行PCR鉴定，获得对应的DNA片段。将3种重组质粒进行测序鉴定，测序结果显示重组质粒中的外源基因序列与GenBank中O型口蹄疫病毒基因序列比对，同源性为100%，说明VP1、VP2和VP1-VP2已分别插入到pcDNA3.1质粒中，成功构建了重组真核表达载体。将构建的3种真核表达载体包裹为多层磷酸钙纳米颗粒，检测其粒径、稳定性；将质粒pcDNA3.1-GFP裹成多层磷酸钙纳米颗粒，以检测此种纳米颗粒体外转染细胞效率。试验结果显示该纳米颗粒粒径大小约为530nm，粒径小于600nm，易于被细胞内吞。置于4℃过夜后，该颗粒复合体均匀透明，无沉淀生成，显示该纳米颗粒稳定性较好。通过转染HEK293细胞，发现此种颗粒复合体转染效率约为9.6%，显示其能有效的携带DNA进入细胞内。

综上所述，本研究获得了O型FMDV VP1 141-160aa和VP2 1-33aa的核苷酸片段的重组质粒，并将其包裹成有效转染细胞的多层磷酸钙纳米颗粒，为O型口蹄疫新型重组基因疫苗的进一步研究奠定了基础。本研究中构建的O型口蹄疫病毒VP1和VP2重组基因多层磷酸钙纳米颗粒在体外获得了一定的转染效率，而在体内多层磷酸钙纳米颗粒能否有效负载FMDV免疫原性DNA，VP1和VP2能否高效表达，以及VP2是否增强VP1的免疫原性，都将是我们进一步研究的内容。

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Construction of a Recombinant VP1 and VP2 of Type O Foot-and-Mouth Disease Virus DNA Vaccine Coated with Multi-shell Calcium Phosphate Nanoparticles

TANG Dong-mei，FU Li-xin，ZHOU Biao，GUO Zheng-hong，YAN Heng-xiu
（College of Life Sicence and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Abstract：A recombinant gene vaccine containing VP1and VP2genes which encoding VP1 141-160and VP2 1-33aa of type O foot-and-mouth disease virus coated multi-shell calcium phosphate nanoparticles was constructed.The VP1and VP2genes encoding VP1 141-160and VP2 1-33aa of type O FMDV were synthesized and linked as recombinant VP1-VP2gene，whose sequences came from the Genbank.Then the VP1gene and VP2gene were amplified by PCR from the recombinant VP1-VP2gene.After that，the VP1 gene，VP2gene and the recombinant VP1-VP2gene were constructed separately into eukaryotic expression vector pcDNA3.1as recombinant plasmids pcDNA3.1-VP1，pcDNA3.1-VP2and pcDNA3.1-VP1-VP2. Then the recombinant plasmids were identified by enzymatic digestion，PCR and sequence analysis.At last，the plasmids DNA were encapsulated in multi-shell calcium phosphate nanoparticles.And the diameters，stability and transfection efficiency of these nanoparticles were detected in vitro.The enzymatic digestion and PCR assay of the recombinant plasmids indicated that the exogenous gene was cloned successfully into expression vector pcDNA3.1.Sequence analysis indicated the recombinant plasmids were 100% homology with the sequence of FMDV in GenBank.The average diameters of conducted nanoparticles were about 530nm detected by particle sizer.The stability analysis showed that the nanoparticles were transparent，well-distributed and deposit-free after stored at 4℃for 24hours.The transfection efficiency of the CaPi-pDNA-GFP on human embryonic kidney 293（HEK 293）cells in vitro was about 9.6%.The recombinant new gene plasmid embedded multi-shell calcium phosphate nanoparticles was successfully constructed.These results encouraged further research for the development of DNA vaccines against FMDV" O" and provided the basis of research for DNA vaccines.

Key words：Foot-and-mouth disease virus；multi-shell nanoparticle；VP1gene；VP2gene；calcium phosphate；DNA vaccine

作者简介：唐冬梅（1988-），女，四川眉山人，硕士研究生，主要从事动物免疫学研究。＊通讯作者

基金项目：西南民族大学研究生创新型科研项目资助（CX2014SZ86）

收稿日期：2015-01-20

中图分类号：S852.659.6；Q786

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）07-0001-06