杂交沙棘新品种深-杂的组织培养研究

田新华 , 卢慧颖 , 曹焱 , 殷东生

(黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨150081)

杂交沙棘新品种深-杂的组织培养研究

田新华 , 卢慧颖 , 曹焱 , 殷东生

(黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨150081)

以杂交沙棘新品种深-杂为供试材料，探索筛选适合苗木繁殖的培养基配方及条件。试验表明：增殖培养配方为：1/2MS(大量元素、钙盐减半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L为杂交沙棘的分化增殖培养基，分化芽苗数较多，达到3.89倍，苗木高度适中。生根培养基：1/4MS(大量元素、钙盐为正常值的1/4)+6-BA0.3 mg/L+IBA0.5 mg/L，生根率达87.5%，茎基部生根，根粗壮侧根多。

杂交新品种；组织培养；苗木繁育

沙棘是胡颓子科(Elcrecrgrlcreecre)沙棘属(HippophcreL.)植物。我国有6种8亚种是沙棘面积和沙棘资源蕴藏量最大的国家[1-3]。

沙棘含有丰富的营养成分，其中沙棘油被誉为“生命之油”，在提高人体免疫功能，预防并抑制肿瘤发生方面应用前景广阔[4-7]；果实加工成果汁、果醋、果酱等各种饮料和食品，保健价值很高[8-9]，沙棘汁含有超氧化物歧化酶，具有清除细胞膜上自由基和抗氧化作用及抗癌作用。

沙棘繁殖技术中研究最多、应用最广的是扦插育苗，但受材料数量限制，难以快速大量生产。本研究针对杂交沙棘新品种(系)深-杂展开组培快繁技术研究，筛选不同培养阶段的适宜培养基配方，并分析不同培养条件对沙棘组织培养的影响，探索杂交沙棘新品种(系)组织培养中存在的主要问题及克服方法，旨在建立一套完整的良种繁殖配套体系，使良种与良法结合，为今后优良品种大规模工厂化育苗提供技术支持。

1 试验材料与处理

黑龙江省林科院内种植沙棘杂交新品种(系)深-杂的枝条。

将室外剪取的深-杂的枝条采回后用加洗衣粉的自来水浸泡30 min，再用牙刷刷洗掉表层尘垢，流水冲洗15 min，最后用加洗洁净的自来水浸泡刷洗后，流水冲洗干净，根据需要截成10～15 mm长的茎段准备消毒接种。

将茎段置于超净工作台上进行灭菌处理：(1)75%酒精浸泡30s，0.1%HgCl2浸泡2 min，然后用无菌水冲洗3次；(2) 75%酒精浸泡30s，0.1% HgCl2浸泡3 min，用无菌水冲洗3次；(3)0.1% HgCl2浸泡2.5 min，然后用无菌水浸泡40 min；(4) 0.1% HgCl2浸泡3.5 min，然后用无菌水浸泡40min；以上材料灭菌后取出，用无菌滤纸吸干材料表面多余水分。每组处理30个茎段，4d后观察效果。

2 试验方法

2.1 诱导侧芽生长

以1/2MS(大量元素、钙盐减半)为基本培养基，在无菌条件下将单芽茎段接种于1/2MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.5 mg/L+20g/L蔗糖+琼脂粉6g/L培养基上诱导腋芽苗生长。

2.2 试管苗分化增殖培养

表1 因素水平表

待茎段腋芽伸长后，分别转接于以1/2MS为基本培养基，添加6-BA、ZT激素不同浓度的培养基进行增殖培养，筛选优化杂交沙棘试管苗的增殖培养基配方。以6-苄基腺嘌呤(6-BA)，生长素(IAA)为2个因素，每因素设置3个水平。采用L9(34)正交试验设计表进行芽增殖培养基筛选。每个处理2次重复，每个重复接种10瓶，培养25d调查苗高、分化增殖情况。

2.3 试管苗生根培养

将经过分化增殖培养、同一簇生长的试管苗，以2棵为1组转入下列4种不同的生根培养基进行生根培养。

Ⅰ 1/4MS(大量元素、钙盐为正常值的1/4)+NAA0.4 mg/L +KT0.3 mg/L；

Ⅱ 1/4MS(大量元素、钙盐为正常值的1/4)+6-BA0.3 mg/L +IBA0.5 mg/L；

Ⅲ 1/2MS(大量元素、钙盐为正常值的1/2)+IBA0.5 mg/L；

Ⅳ 1/2MS(大量元素、钙盐为正常值的1/2)+NAA0.2 mg/L；

每个处理2次重复，每个重复接种10瓶，培养35d调查苗木生根情况。培养基中添加蔗糖20g/L，日产琼脂粉6g/L，pH值调至5.8，培养温度白天25±1℃，夜间20±1℃，光照强度2000 lx，光照时间12h/d。培养温度白天25±1℃，夜间20±1℃，光照强度2000 lx，光照时间12h/d。

2.4 杂交沙棘移栽试验

挑选生根质量好的试管瓶苗置于遮荫的阳台上炼苗，预培养5d。然后对试管苗进行移栽试验研究，筛选适合的移栽基质及培养条件。

2.5 统计分析方法

采用Microsoft Excel 2003的统计工具进行计算并作图，dps7.05数据统计软件对试验数据进行方差分析和差异显著性测验(SSR法)[10]。

3 结果与分析

3.1 不同灭菌方法的灭菌效果

表2 不同灭菌时间的灭菌效果

获取初始材料的一个重要制约因素就是初代培养的高污染率，所以选用适宜的灭菌方法至关重要。由表2可以看出，处理1灭菌不充分，污染率较高43.3%；处理2污染率和褐化率均高，不适合沙棘外植体消毒处理；处理4灭菌过度，尽管没有污染，但苗木已经大量褐化，严重影响外植体的生长；处理3即用0.1%升汞浸泡2.5 min的灭菌方法，污染率为10%，褐化率6.7%，其余外植体表现正常，是较适宜的灭菌方法。

3.2 诱导侧芽生长

经1/2MS(大量元素、钙盐减半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.5 mg/L+20g/L蔗糖+琼脂粉6g/L培养的沙棘腋芽培养1周左右开始萌动，节间伸长、叶片展开，颜色新绿。

3.3 试管苗增殖培养基的筛选

将经初代培养的试管苗切成1.0 cm左右的茎段转接入不同激素组合的增殖培养基中培养。通过观察各处理培养25 d后的试管苗可知，因激素的种类、浓度的不同，不定芽的生长状况表现出明显的不同。茎段或茎尖的离体增殖率受到培养基中细胞分裂素的调控，伸长生长除受细胞分裂素调控外，还受生长素的调控。将试管苗各性状测量结果进行极差分析(见表3)，极差大的因素对相应性状影响较大。结果表明，就苗高这一性状主要受6-BA控制，而分化增殖苗数决定于IAA。

表3 不同激素对植株上部各性状极差的影响

表4 不同处理对杂交沙棘试管苗不同性状方差分析

表5 不同处理植株上部性状多重比较

注：要求芽苗高度≥0.3cm

经方差分析(见表4)表明，无论对于控制试管苗分化增殖数，A、B两因素不同水平间差异均极显著(P<0.01)，而对于试管苗向高生长则6-BA各水平间差异显著(P<0.01)。按F值分析，F值大的因素对结果影响较大，结果也与上述分析一致。经植株上部生长情况的多重比较结果显示(见表5)，以处理1培养的试管苗向高生长最快，只与处理2间差异显著；以处理1培养的试管苗分化增殖倍数最多，与其它处理间差异显著(P<0.05)。综合上述结果，选择培养基(即处理1)1/2MS(大量元素、钙盐减半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L为杂交沙棘的分化增殖培养基，分化芽苗数较多，苗木高度适中。

3.4 杂交沙棘试管苗生根试验

将经过分化增殖培养、同一簇生长的试管苗，以2棵为1组转入4种不同的生根培养基进行生根培养，培养35d调查苗木生根情况(见表6)。

试验结果可知，不同培养基对沙棘杂交品种的生根作用是不同的，诱导产生的根的状态也不近相同，以处理Ⅱ培养的试管苗生根效果较好，即生根培养基配方为1/4MS(大量元素、钙盐为正常值的1/4)+6-BA0.3mg/L+IBA0.5mg/L。

表6 不同培养基对杂交沙棘深-杂的生根诱导作用

3.5 沙棘的移栽试验

挑选生根质量好的试管瓶苗置于遮荫的阳台上炼苗，预培养5d(增加光照，提高自身抗性，进行壮苗处理)。然后逐步去除封口膜，降低湿度，保持3～5天后准备移栽。

将炼过的生根苗从瓶中取出，洗净根系粘附的培养基，试管苗基部速蘸0.5%KMnO4消毒，然后浸蘸生根激素ABT 1000mg/L 30s，斜插入经消过毒的不同基质中，利用雾化器进行雾化培养，湿度控制在80%，温度控制在30～35℃。

移栽基质选择非常重要，它决定着生根苗移栽后的成活率和生长状况，蛭石有良好的透气性，质地疏松柔软，草炭保水性较好，含有一定营养利于生根苗成活，将草炭、蛭石、细沙按不同比例配比好，用饱和KMnO4消毒灭菌30min后大量清水冲洗，然后用塑料薄膜覆盖阳光曝晒24h以上供移栽使用。

移栽时用筷子开穴，保证生根苗根系舒展，不出现折根、断根即可，栽植深度约2cm，栽后浇透自来水，间隔10d浇10%的MS，相对湿度控制在80%左右。2～3周幼苗生长正常时置于遮荫的光照强的地方，加强幼苗光合作用，促进自养。

将生根苗木移栽入细砂∶草炭∶蛭石为1∶1∶1的松软基质中，放置在塑料棚中保持相对湿度80%左右，温度控制在25±2℃的条件下培养20d，移栽苗几乎不生长或仅有少量生长且下部叶片稍有发黄，这可能与组培苗长期在异养的环境中生长，出瓶后根系吸收能力很弱甚至无吸收功能有关。此后移栽苗茎尖开始生长，新叶嫩绿，与老叶形成明显对比。因此，选用细砂∶草炭∶蛭石为1∶1∶1的移栽基质有利于苗木成活。

表7 不同基质对苗木成活率的影响

4 讨论

4.1 沙棘品种很多，从各品种基因型及生物学特性等方面考虑，在相同条件下反应会有所不同。

4.2 通常1个叶腋长出1个腋芽，当材料培养驯化到一定阶段，处于对激素高度敏感状态时，新长出的腋芽每个叶腋又可长出一个腋芽，从而诱导出二级、三级腋芽，出现芽上生芽的丛生状态，标志着腋芽增殖的成功。本试验的研究结果：1/2MS(大量元素、钙盐减半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L为杂交沙棘的分化增殖培养基，分化芽苗数较多，苗木高度适中。

4.3 褐化是木本植物组织培养中常见的问题，沙棘体内酚类物质含量高，褐化问题突出，抑制其褐化在组织培养过程中尤为重要。

4.4 影响试管苗人工移栽驯化的重要因素包括：生长环境(温度、湿度、光照)、基质的通气透水性、肥力等情况。本试验采用了富含腐殖质的草炭和透气性良好的沙子、蛭石配合在一起即可保证试管苗移栽后的养分供应，又有一定的通气透水性。

[1]康水善,陈学林. 沙棘属植物的系统分类[J]. 沙棘,1996,9 (1):15-24.

[2]陈学林.康水善. 沙棘属植物的分布格局及其成因[J]. 沙棘,1996,9 (2):15-21.

[3]康水善,陈学林,于淖德,等. 沙棘属植物起源的研究[J] . 沙棘,1997,1 (2):17.

[4]Antonio Flavio Paoletti. Marco antonelli Changes in Sugar.Organic acid.flavond and carotenoid composition during ripening of berries of three Seabucktbom(HipophaerhamnoidesL.) [J].Cultivars. European Food Research and Technology,219(4): 360-368.

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[7]Cbeng Jiayi Kondo.Suzuki Yasubiro. Inhibitory effects of total flavones ofHippopbaerhamnoidesL.on thrombosis in mouse femoral artery and in vitro platelet aggregation[J]. Life Sciences,2003.72(20): 2263-2272.

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[10]唐启义,冯明光. 实用统计分析及其DPS数据处理系统[M].北京:科学出版社, 2002.

2014-09-18

国家林业公益资助项目( 201004068 )；省财政自拟项目(寒地浆果无性繁殖技术研究；寒地浆果无性扩繁及工厂化育苗技术研究)

田新华(1976-)，女，副研究员，遗传育种专业，E-mail：hrbtxh@163.com。

S793.6

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.02.005