嗜热偶氮染料降解复合菌群的构建及其降解培养基的优化

张庆华，胡景华，李芳良，陈　浪，涂慧敏

(江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045)

嗜热偶氮染料降解复合菌群的构建及其降解培养基的优化

张庆华，胡景华，李芳良，陈浪，涂慧敏

(江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌330045)

摘要：从富含偶氮染料的环境中取样，通过在含有偶氮染料的富集培养基中不断驯化培养，构建了一组高效稳定的偶氮染料降解复合菌群。该菌群在添加600 mg/L直接黑染料的降解培养基中55 ℃静置培养9 h，其脱色率可达83.56%。为进一步提高该菌群对偶氮染料的脱色效果，通过响应面分析法对其降解培养基进行优化。首先由Plackett-Burman试验确定影响染料直接黑降解的3个主要因素为葡萄糖、蛋白胨以及FeCl3，随后通过中心组合试验和响应面分析确定最优的培养基配方为(g/L)：葡萄糖11.48、蛋白胨5.1、FeCl30.12、牛肉膏 4.5、K2HPO42.7、NaH2PO45.25、MgSO40.4和MnSO40.05。经优化以后，在含有0.6 g/L直接黑染料的培养基中55 ℃静置培养9 h，该复合菌群对偶氮染料直接黑的脱色率高达99.24%，展现出了较大的应用潜力。

关键词：复合菌群；偶氮染料；降解；响应面分析法

随着世界经济的快速发展，大量种类不同的合成染料被广泛应用于工业生产之中，且其中很大一部分染料以废水的形式存在，造成了极大的环境污染问题[1-2]。在这些染料中，拥有一个或多个偶氮基团(-N=N-)的芳香化合物——偶氮染料是最为常见和最大种类的合成染料，广泛应用于纺织、造纸、塑料、化妆品、皮革制品等行业中[3]。由于偶氮染料具有良好的稳定性和持久性，且具有诱变和致癌能力[4]，一旦排入到环境中将造成严重的危害。

目前，染料废水的脱色方法主要有化学法[5]、物理法[6]和生物法[7-12]等，其中物理和化学方法大多存在成本高、二次污染等问题，难以实现规模化应用[13]。而采用生物法来处理偶氮染料由于具有生态友好、投资少、能耗低、产生的污泥少等优势受到了广泛的关注[14]。在生物处理法中，复合菌群脱色技术相对于微生物纯培养来说更符合自然界中合成染料的微生物降解规律[15]，能够通过多种微生物高效降解染料的不同部位并借助微生物之间的协同作用实现偶氮染料的彻底降解，成为了当前的研究热点[16]。由于大部分的染料废水主要产生于染浴和漂洗工序，在排放时温度高达50～70 ℃[17]，为此采用高温复合菌系来降解染料废水拥有良好的工艺匹配性。此外，高温复合菌系在降解染料时具有降解速度快、可杀灭废水中的病源菌、污染少、降温费用低等显著优点，且菌系中的高温菌酶还能极大程度地耐受不良化学环境、抵抗有毒污染物或代谢产物的抑制作用、拥有较强的稳定性和适应性，因而具有广泛的开发应用潜力。

本实验通过在富含偶氮染料的土壤中取样、不断富集，定向构建了一组具有广谱降解功能的嗜热偶氮染料降解复合菌系。由于培养基的成分对菌体的生长和酶的分泌都有着重要的影响，为此有必要对染料降解培养基进行优化从而进一步提高复合菌群对偶氮染料的脱色能力。

近年来，许多研究表明采用响应面优化等统计学方法来优化发酵培养基，可以明显提高产物的产量[18-19]。通过Plackett-Burman设计、最陡爬坡实验以及响应面分析完成发酵培养基的优化。其中，Plackett-Burman(PB)法是一种近饱和的二水平试验设计方法，能用最少试验次数估计出因素的主效应，以从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究[20]。响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义。所以，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程[20]。快速登高法实验是以实验值变化的梯度方向为登高方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域[21]。为此，本研究亦采用响应面优化法来确定复合菌系对偶氮染料直接黑降解的最优培养基配方。

本实验选用Plackett-Burman实验设计，对葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、FeCl3和MnSO4共8个因素进行考察，以脱色率为响应值，进行各因素主效应分析。利用CCD设计，设计3因素5水平共20个实验点的响应面分析实验，最终确定染料降解培养基的最佳配方。该研究的顺利开展有利于充分发掘该复合菌群对偶氮染料的降解潜力，为该菌群的大规模开发利用奠定一定的研究基础。

1材料与方法

1.1材料

(1) 偶氮染料：实验所用偶氮染料为直接黑(分子式为C34H25N9Na2O7S2)，购于武汉华美华科技(集团)有限公司。

(2) 富集培养基(g/L):蛋白胨2.0、牛肉膏3.0、葡萄糖5.0、KH2PO41.8、NaH2PO4·12H2O 3.5、MgSO4·7H2O 0.2、FeCl3·7H2O 0.01、MnSO4·7H2O 0.02、直接黑 0.01，pH7.2。

(3) 降解培养基(g/L):蛋白胨2.0、牛肉膏3.0、葡萄糖5.0、KH2PO41.8、NaH2PO4·12H2O 3.5、MgSO4·7H2O 0.2、FeCl3·7H2O 0.01、MnSO4·7H2O 0.02、直接黑0.6，pH7.2。

1.2实验药品及仪器

实验药品均为国产分析纯。实验主要仪器：Sartorius电子天平，塞多利斯公司；PHS-3E型精密pH计，上海雷磁仪器厂；723型可见光分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；BPH-9082恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1偶氮染料降解复合菌群的富集筛选分别从江西某纺织公司印染车间排污口不同位置采样，保存于无菌的玻璃三角瓶中备用。加入少量的无菌水混匀后，吸取水样5 mL，加入到含有富集培养液的三角瓶中，于55 ℃培养箱中静置培养。当三角瓶内的染料基本降解时(培养液不再是明显的黑色)，取10 mL的培养液接种到新鲜的富集培养基中，同时淘汰没有明显降解能力的样品(培养液仍旧呈现黑色)，如此传代培养几个周期，结合脱色时间和脱色率，从中挑选出几组效果良好的培养液。最后将降解液按照两两或者全部混合的组配方式接种筛选并连续传代培养，待菌群稳定后得到一组偶氮染料降解复合菌群。

1.3.2偶氮染料降解复合菌群的驯化为提高复合菌群降解偶氮染料的性能，将上述筛选得到的复合菌群按照5%的接种量接种于富集培养基中于55 ℃静置培养直到黑色消失为止。随后将富集培养基中直接黑染料的浓度不断提高进行驯化培养，经过14个批次的驯化(各个批次的染料浓度分别为：0.01、0.02、0.04、0.06、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.45、0.5、0.55、0.6 g/L)，待菌群稳定后最终得到1组高效的偶氮染料降解复合菌群。通过分子生物学方法分析，发现该复合菌群主要由Anoxybacillussp.，Brevibacillussp.和芽孢杆菌等近8种染料降解和非降解微生物所组成。

1.3.3偶氮染料降解复合菌群脱色能力的测定将上述菌群接入染料降解培养基55 ℃静置培养9 h后，取适量培养液8 000 r/min离心10 min，将上清液在直接黑染料的最大吸收波长650 nm处用分光光度计测其OD值，并以不接种的染料培养基为对照，计算脱色率，以表示其对染料的脱色能力。

脱色率=(A-B)/A×100%

(1)

其中A：不接种菌液的OD值；B:接种菌液的OD值。

1.3.4染料降解培养基优化实验设计(1)Plackett-Burman设计。每个变量设计高低2个水平。本实验初步确定所要考察的8种组分:葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、FeCl3和MnSO4，每个因素取两个水平，响应值为脱色率。

(2)最陡爬坡实验。根据PB试验得出的一次拟合方程安排最陡爬坡试验。一次拟合方程中，各变量的系数决定爬坡方向和变化步长，如果系数为负，则该因素水平应为递减，反之为递增，系数越大变化步长越小。

(3)响应面分析。根据CCD中心组合设计原理，由Plackett-Burman设计筛选出3个重要影响因素各取5水平，设计了3因素5水平共20个实验点的响应面分析。本实验用统计分析软件Design-Expert对试验结果进行分析。

2结果与分析

2.1偶氮染料降解复合菌群的构建结果

将接种复合菌群的培养液于55 ℃静置培养不同时间观察染料的降解效果(图1)。由图1可见，将复合菌群接种于降解培养基中经9 h的静置培养后，发现染料的黑色完全褪去并变成淡黄色。此外，通过20个批次的连续传代培养发现该复合菌群普遍表现出良好的脱色效果，这表明构建的偶氮染料分解复合菌群具有良好的稳定性，并且可以高效分解偶氮染料直接黑。

图1　复合菌群对偶氮染料直接黑的降解效果对比(A:0 h;B:9 h)Fig.1　Comparison of degradation effect of azo dyes of direct black by the microbial consortium (A:0 h;B:9 h)

2.2影响复合菌群脱色率关键因素的确定

选取8个因素，试验次数为12的Plackett-Burman设计，其中每组设置3个平行，考察各因素的主效应和交互作用的一级作用，确定重要影响因素。Plackett-Burman实验设计与响应值(脱色率)见表1。

表1　Plackett-Burman实验设计和结果

由于当Pr>F值小于0.05就表明模型显著，根据表1结果利用Design-Expert软件进行显著影响因子分析得出模型的Pr>F为0.025 6，所以该模型显著，其结果见表2。

表2　Plackett-Burman实验分析结果

由表2可见，影响染料脱色率因素显著性由大到小依次为葡萄糖、蛋白胨、FeCl3、MnSO4、牛肉膏、NaH2PO4、MgSO4和KH2PO4。对直接黑脱色率具有显著影响的3个因素中，葡萄糖、蛋白胨以及FeCl3均对脱色率表现为正效应，因此按照一定的梯度不断增大葡萄糖、蛋白胨以及FeCl3含量，设计12组实验，每组设置3个平行，以最快的速度逼近响应面区域。

2.3最陡爬坡路径的确定

由Plackett-Burman实验可知，葡萄糖和蛋白胨以及FeCl3这3个因素对脱色率有重要的影响，而且都存在显著正效应。为此，根据这3个因素效应值大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验，设计及结果如表3所示。

表3　最陡爬坡实验设计和结果

由表3可知，最优条件在处理7和处理8之间，故选取葡萄糖=11 g/L，蛋白胨=5 g/L，FeCl3=0.12 g/L为后续响应面试验的中心点。

表4　中心组合设计实验结果

2.4中心组合试验设计

根据Plackett-Burman实验确定的3个重要因素葡萄糖、蛋白胨和FeCl3以及中心组合设计(CCD)原理，以脱色率为响应值，设计3因素5水平共20个实验点的响应面分析实验。结果如表4所示。

用Design-Expert软件对实验数据进行分析，其响应面二次模型的方差分析结果如表5所示。

表5　响应面二次模型的方差分析

**为差异极显著(P<0.01);*为差异显著(P<0.05)。**means very significant differences;* means significant difference．

由模型推导出的等式(1)描述了这些显著参数和响应值脱色率在编码水平的相互关系。该方程如下所示：

脱色率(%)=97.98+0.85A+0.31B-0.005 093C-0.11AB+0.065AC-0.15BC-0.86A2-0.62B2-0.58C2

(1)

该回归方程各个回归系数的显著性分析均通过F和P值进行检验。由于Pr>F的值小于0.050 0就表明该模型是显著的，由表5可见该模型显著。失拟项的Pr>F值为0.323 7，表明该模型失拟项不显著，说明建立的上述模型可以代替试验值来解释响应结果。

通过Design-Expert软件分析得到染料降解培养基的最优组合为：葡萄糖11.48 g/L、蛋白胨5.1 g/L、FeCl30.12 g/L、牛肉膏4.5 g/L、K2HPO42.7 g/L、NaH2PO45.25 g/L、MgSO40.4 g/L、和MnSO40.05 g/L。

2.5响应面分析

在前面建立的回归模型基础上，本研究通过绘制的响应面和等高线图分别分析了3个参数之间的交互关系并确定了最大响应值下各参数的最优水平。基于等式1绘制的响应面和等高线图见图2。

当FeCl3设定为中心点处的恒定值时，葡萄糖浓度和蛋白胨浓度对脱色率的影响如图2-(a)所示。在预处理过程中随着葡萄糖浓度和蛋白胨浓度的提高，经预处理后脱色率上升到了一定的程度，但是进一步提高葡萄糖浓度或者蛋白胨的浓度，则会导致随后的脱色率下降。同样的现象在图2-(b)和2-(c)中也可以看到，其中图2-(b)表示蛋白胨浓度设定在中心点时，葡萄糖浓度和FeCl3浓度对脱色率的影响，而图2-(c)则表示葡萄糖浓度设定在恒定值时，FeCl3浓度和蛋白胨浓度对脱色率的影响。

图2　脱色率的响应面和等高线图(a:葡萄糖和蛋白胨的交互作用；b:葡萄糖和FeCl3的交互作用；c:蛋白胨和FeCl3的交互作用)Fig.2　The response surface and contour line of decolourization ratio (a:Interaction between Glucose and Peptone;b:Interaction between Glucose and FeCl3;c:Interaction between Peptone and FeCl3)

2.6最佳条件下复合菌群对染料的降解效果分析

图3　不同培养时间下的脱色率变化情况Fig.3　Change of the decolourization ratio under different incubation time

为了研究复合菌群在最优条件下的降解效果，按照优化后的培养基配方进行配制，同时加入直接黑染料，控制其终浓度为0.6 g/L，随后接入5%的复合菌群于55 ℃下静置培养不同时间(图3)。由图3可见，从0～9 h复合菌群对染料脱色率显著提高，到9 h时其脱色率达到了99.24%，随后进一步延长培养时间其脱色率基本保持稳定，这与我们优化的结论一致。

3结论与讨论

本研究通过定向富集驯化得到了一组高效的嗜热偶氮染料降解复合菌群，该复合菌群展现出了良好的偶氮染料降解能力。通过响应面法优化确定了该复合菌群降解偶氮染料直接黑的最佳培养基配方为：葡萄糖11.48 g/L、蛋白胨5.1 g/L、FeCl30.12 g/L、牛肉膏4.5 g/L、K2HPO42.7 g/L、NaH2PO45.25 g/L、MgSO40.4 g/L和MnSO40.05 g/L。经过优化以后，该复合菌群在55 ℃下静置培养9 h能将0.6 g/L的直接黑染料有效降解，其脱色率高达99.24%。

采用生物法对偶氮染料进行有效降解是当前的一个研究热点。在生物处理过程中由于大多数单菌对偶氮染料降解的广谱性差、环境适应能力弱、脱色速度慢从而无法满足实际废水处理的要求[22]。采用微生物混合培养的模式可借助微生物之间的代谢互补或共代谢作用实现偶氮染料分子的高度降解和矿化，从而提高染料的降解能力和速度[23]。本研究构建的复合菌群能在55 ℃ 9 h的静置培养过程中将600 mg/L的偶氮染料高效降解，比文献报道的偶氮染料降解复合菌系处理染料的浓度(200 mg/L)和时间(16～24 h)上具有一定的优势[24-25]，此外由于常规偶氮染料废水中的染料浓度仅为10～200 mg/L[26]，本研究得到的染料降解复合菌群展现出了较大的工业化应用潜质。后续将进一步研究该复合菌群中各类染料降解酶的作用以及染料的降解途径，此举将有利于此复合菌系在资源利用、水循环和生态修复方面产生较大的环境和社会效益。

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Construction of A Thermophilic Microbial Consortium for Azo Dyes

Degradation and Optimization of Its Degradation Medium

ZHANG Qing-hua,HU Jing-hua,LI Fang-liang,CHEN Lang,TU Hui-min

(College of Bioscience and Bioengineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:A microbial consortium with high effective and stable azo dye degradation ability was constructed by successive domestication in the enrichment medium containing azo dyes,where the inoculums were sampled from the environment filled with azo dyes.The decolorization ratio in this microbial consortium could reach 83.56% when incubated in the degradation medium containing 600 mg/L of direct black at 55 ℃ for 9 h.In order to further increase its decolourization ratio to azo dyes,response surface methodology was utilized to optimize the degradation medium.Firstly,Plackett-Burman test was utilized to identify the most significant factors influencing the decolourization ratio.It was found that the three main factors affecting the dye decolorization rate were Glucose,Peptone and FeCl3.Subsequently,central composite design and response surface analysis were utilized to optimize the degradation medium.It was found that the optimum combination (g/L) was:Glucose 11.48,Peptone 5.1,FeCl30.12,Beef Extract 4.5,K2HPO42.7,NaH2PO45.25,MgSO40.4 and MnSO40.05.After optimization,the decolorization ratio of microbial consortium increased to 99.24% showing obvious application potential.

Key words:microbial consortium；azo dyes；degradation;response surface methodology

作者简介：张庆华(1979—)，男，讲师,博士，主要从事发酵与环境微生物学研究，E-mail:zqhnet@163.com。

基金项目：江西省教育厅科技项目(GJJ14297)和江西农业大学大学生创新训练计划项目(201410410088)

收稿日期：2014-09-12修回日期：2014-10-21

中图分类号：TQ613.1

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)01-0126-09