蓝莓对酒精性脂肪肝小鼠肝组织HO-1表达及抗氧化能力的影响*



蓝莓对酒精性脂肪肝小鼠肝组织HO-1表达及抗氧化能力的影响*

网络出版时间：2015-03-19网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1006.020.html

黄超**， 任婷婷， 王豫萍， 程明亮***

(贵阳医学院 感染科教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 研究蓝莓对酒精性脂肪肝(AFLD)小鼠肝组织中血红素氧化酶-1(HO-1)表达水平及抗氧化能力的影响，探讨蓝莓对AFLD的保护作用及可能机制。方法： 40只C57/6J小鼠随机均分为对照组、蓝莓组、蓝莓+HO-1抑制剂(锌原卟啉，ZnPPIX)组及模型组，NIAAA法建立AFLD动物模型，油红O染色法检测模型建立情况及各组小鼠肝组织病理学变化；取眼眶血检测各组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，甘油三脂(TG)，胆固醇(TC)含量；酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组小鼠肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量；Western blot法检测各组小鼠肝组织中HO-1蛋白的表达。结果： 蓝莓组肝组织脂肪沉积较模型组及蓝莓+ZnPPIX组明显减少，血清中ALT、AST、TG及TC含量降低(P<0.05)，肝组织中SOD活性和GSH含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)；蓝莓组HO-1蛋白表达量高于蓝莓+ZnPPIX组及模型组。结论： 蓝莓可减轻AFLD，其机制可能与上调小鼠肝脏HO-1的表达，增强机体抗氧化能力有关。

[关键词]脂肪肝,酒精性； 蓝莓； 氧化应激； 血红素氧化酶-1； 肝功能试验

乙醇代谢所引起的氧化应激、脂质过氧化、线粒体损伤以及细胞防御体系的激活是酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)的主要发病机制，临床上使用抗氧化剂治疗AFLD具有较好的疗效[1-5]。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)对多种氧化损伤有良好的保护作用，已成为目前研究预防氧化攻击的首选靶基因之一。蓝莓中富含的花青素、多酚类和黄酮类化合物是果品中少有的特殊成分，具有明确的抗氧化活性，被称为果蔬中“第一号抗氧化剂”。本实验通过建立AFLD动物模型，以HO-1为研究重点，观察在蓝莓及HO-1抑制剂(ZnPPIX)干预下小鼠肝脏脂肪沉积、肝功能损伤指标、抗氧化指标及HO-1蛋白表达的变化，探讨蓝莓对小鼠AFLD的干预作用及可能作用机制。

1材料与方法

1.1　材料与仪器

蓝莓(兔眼品种)产于麻江县蓝莓生产基地，-20 ℃保存，使用时临时榨汁提取原浆使用；利伯DeCarli'82对照组饲料，利伯DeCarli'82损伤饲料(江苏特洛菲饲料科技有限公司；F1259SP，F1258SP)；锌原卟啉(ZnPPIX)溶液(Sigma公司)；谷胱甘肽(GSH)酶联免疫分析试剂盒、丙二醛(MDA)酶联免疫分析试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫分析试剂盒(上海凯基)；HO-1兔抗鼠多克隆抗体一抗(ABCAM)，羊抗兔多克隆抗体二抗(上海基因工程)，GAPDH兔抗鼠抗体(武汉博士德生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂购(Biomiga生物有限公司)，ECL化学发光试剂(百乐公司)；显微镜图像采集系统(OLYMPUS，BX41)，MSS全波长酶标仪(BioTec)，电泳仪(自北京市六一仪器厂，1DYCZ-24DN型)，高速低温离心机(sigma3K15)；全自动生化分析仪(日本ADVIA2400)，其他试剂均用分析纯。

1.2　动物分组建模

C57BL/6J雌鼠(购于贵阳医学院动物实验中心)40只，8~10周龄，体质量(16±2)g；小鼠适应性喂养2周，随机均分为对照组(A组)，蓝莓组(B组)，蓝莓+ZnPPIX组(C组)，模型组(D组)。参照NIAAA法，对照组饲喂DeCarli'82对照饲料，其余各组饲喂DeCarli'82损伤饲料，建立AFLD模型。各组小鼠均严格按照说明书流程饲喂对应的利伯DeCarli'82饲料10 d。B组在饲喂损伤饲料的同时进行蓝莓原浆灌胃(1.5 mL/100 g)；C组灌胃蓝莓方法同B组，同时用ZnPPIX溶液(10 mg/kg)经腹腔注射。

1.3　观察指标

造模10 d后，各组小鼠禁食水24 h，于处死动物前9 h，A组灌胃精糊(灌胃量=体质量×20 μL)，其余各组灌胃30%乙醇溶液(灌胃量=体质量×20 μL)。9 h后各组小鼠麻醉脊柱脱颈处死，取眼眶血分离血清检测谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，甘油三脂(TG)，胆固醇(TC)检测。取同部位肝脏部分肝组织置于液氮中行冰冻切片液中保存用于油红O染色检测肝组织脂肪化，其余肝组织放入冻存管后-80 ℃冻存，用于检测下面两类指标：(1)肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量，以空白组为参数调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，根据标准曲线公式计算得出肝组织中相应指标。(2)肝组织HO-1蛋白表达，以GAPDH表达水平作为内参照，蛋白的表达量以HO-1蛋白与内参GAPDH对照蛋白灰度值的对比值表示。

1.4　统计学方法

2结果

2.1　小鼠肝组织脂肪化程度鉴定

除A组外，B、C、D组油红染色均可见细胞水肿及红色脂滴，而B、C组肝细胞内红色脂滴明显少于D组，B组肝细胞水肿及脂滴沉积少于C组。

A为对照组，B为蓝莓组，C为蓝莓+ZnPPIX组，D为模型组图1　各组小鼠肝组织油红O染色(×200)Fig.1　Pathological changes of mice liver in each group detected by oil red O staining

2.2　血清ALT、AST、TG及TC

A、B及C组血清中ALT、AST、TG、TC含量低于D组，差异有统计学意义(P<0.05)；C组ALT、AST、TG、TC含量明显高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　各组小鼠血清ALT、AST、TG、TC水平

(1)与D组比较，P<0.05；(2)与B组比较，P<0.05；(3)与A组比较，P<0.05

2.3　肝组织中SOD、MDA、GSH

与D组比较，A、B、C组肝组织中SOD活性、GSH水平明显增高，MDA水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，C组SOD活性、GSH水平明显降低，而MDA水平明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　各组小鼠肝组织中SOD活性、

(1)与D组比较，P<0.05；(2)与B组比较，P<0.05

2.4　肝组织中HO-1蛋白表达

B、D组HO-1蛋白表达高于A组和C组差异均有统计学意义(P<0.05)； B组HO-1蛋白表达高于D组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

(1)与A组比较，P<0.05；(2)与C组比较，P<0.05；(3)与D组比较，P<0.05图2　各组小鼠肝组织中HO-1蛋白的表达Fig.2　The levels of HO-1 in mice liver in each group

3讨论

世界卫生组织《2014年酒精与健康全球状况报告》 显示，2012年全球因有害食用酒精造成330万人死亡，超过艾滋病、肺结核、暴力事件死亡人数的总和，占全球死亡总数的5.9%，其中因酒精性肝病死亡的比例占1/2。而AFLD是酒精性肝病早期的病理改变，若能得到有效控制，将大大降低酒精性肝病的发生。乙醇在肝脏中被乙醇脱氢酶(ADH)、微粒体中的乙醇氧化系统(MEOS)以及过氧化物酶体中的过氧化氢酶分解为乙醛，而其代谢过程将使肝细胞内活性氧(ROS)和氧自由基增多；当生成的ROS和氧自由基超过SOD和GSH等抗氧化因子的清除能力时，将导致细胞的脂质过氧化造成肝细胞线粒体功能紊乱，引起肝细胞脂肪变性，进而发展为AFLD。HO-1是细胞微粒体酶，主要功能是降解血红素生成胆绿素、CO及Fe2-，而胆绿素经胆绿素还原酶的作用生成胆红素，二者均具有抗氧化功能；Fe2-可诱导细胞内铁蛋白的生成，减少自由态铁的含量发挥保护细胞效应。另一方面HO-1产生的CO则通过抑制细胞色素P450 ZE1催化活性和激活生物信号传导，减少细胞氧化毒性损伤[10]。有研究发现，HO-1所主导的抗氧化机制与AFLD的发生发展有着密切的关系[11]。有报道称当细胞处于应激状态时，HO-1可作为保护性蛋白表达增加[12]。

蓝莓由于其强大的抗氧化活性，被WHO/FAD列为最佳的健康食品之一[13]。近年来蓝莓明确的抗氧化、抗炎作用被应用于各领域氧化损伤疾病的防治研究。本课题组在前期的动物实验研究中证实了蓝莓能够通过提高机体的抗氧化能力对CCL4引起的急性肝损伤起到较好的保护作用[14]。推测蓝莓拮抗AFLD的发生发展，机制可能与蓝莓所含的活性物质可调节肝脏中HO-1蛋白的表达并改善机体氧化应激有关。

本实验通过NIAAA法成功复制了小鼠AFLD模型。通过对蓝莓组及模型组小鼠油红染色、肝功能指标的检测发现，蓝莓组小鼠肝组织脂肪沉积明显少于模型组，血清ALT、AST、TG、TC明显低于模型组(P<0.05)，提示蓝莓能够拮抗乙醇代谢引起的肝损伤，减少肝组织中脂肪的沉积。另一方面，蓝莓组较模型组肝组织中MDA水平下降(P<0.05)、SOD活性及GSH水平增加(P<0.05)。而MDA是脂质过氧化的终产物，能够反映肝组织由于氧自由基过量产生所导致的细胞膜损伤程度，肝组织中GSH和SOD的含量及活性能反映肝脏抗氧化应激的水平。提示蓝莓能够增强机体的抗氧化能力，减少乙醇代谢引起的氧化应激损伤。Western blot结果还显示，模型组HO-1的蛋白表达高于正常组(P<0.05)，表明当细胞处于氧化应激状态时，HO-1会应激性地表达上升；蓝莓组HO-1表达高于模型组(P<0.05)，提示蓝莓对AFLD的保护作用可能与上调HO-1蛋白的表达进而提高机体的抗氧化能力有关。本研究进一步通过经典HO-1抑制剂ZnPPIX+蓝莓处理模型小鼠，在灌胃蓝莓的同时抑制HO-1的表达，观察此条件下小鼠的肝脏脂质沉积、生化指标及抗氧化指标的变化。结果显示，蓝莓+ZnPPIX组小鼠油红染色脂肪沉淀、肝血清损伤指标积及MDA含量明显高于蓝莓组(P<0.05)，而肝组织中HO-1蛋白的表达、SOD活性、GSH含量低于蓝莓组(P<0.05)，进一步证实了蓝莓对AFLD的保护作用与肝组织内HO-1的表达变化从而影响机体抗氧化能力与有关。

综上所述，蓝莓对AFLD具有较好的保护作用，其机制可能与诱导HO-1高表达，提高机体的抗氧化能力有关，而蓝莓对AFLD保护作用的深入机制则有待进一步的研究。

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[14]王豫萍,程明亮,张宝方.蓝莓对急性肝损伤大鼠抗氧化能力的影响.肝脏, 2012(9):633-635.

(2015-01-04收稿，2015-02-17修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌

The Influence of Blueberry on Heme Oxygenase-1 Expression and

Antioxidant Ability of Mice with Alcoholic Fatty Liver Disease

HUANG Chao, REN Tingting, WANG Yuping, CHENG Mingliang

(InstituteofInfectiousDiseases,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalcollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of blueberry on heme oxygenase-1 (HO-1) and antioxidant ability of mice with alcoholic fatty liver disease (AFLD), and to explore the protective effects of blueberry on AFLD and possible mechanism. Methods: Forty C57/6J mice were randomly divided into control group,blueberry group,blueberry+ZnPPIX group and model group. AFLD model was established by using NIAAA method, pathological changes in the hepatic tissues were detected by oil red O staining, the orbital blood was taken to detect the levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST)，triglyceride (TG) and total cholesterol (TC).The superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione (GSH) levels, malondialdehyde (MDA)contents inliver tissue were quantified by ELISA.The expression of HO-1 in liver tissue was detected by Western blot. Results: Compared with model group and blueberry+ZnPPIX group, lipid accumulation in liver tissue of mice in blueberry group decreased, serum ALT, AST,TG and TC levels decreased (P<0.05).The hepatic MDA content also decreased (P<0.05), while GSH contents, SOD activity and the HO-1 levels increased (P<0.05). Conclusion: Blueberry can alleviate AFLD, the mechanism may relate to raise the expression of HO-1 in mice, increase the antioxidant capacity.

[Key words]fatty liver, alcoholic; blueberry; oxidative stress; heme oxygenase-1; liver function test

[中图分类号]R363.1； R575.5

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2015)03-0245-04

通信作者***E-mail:mlcheng@yeah.net.

[基金项目]**贵阳医学院2012级硕士研究生