迷迭香酸干预下HBX基因对人肝癌细胞凋亡的影响*

苏杰 姚杨 朱星枚 成碧萍

(西安医学院附属医院中心实验室，陕西 西安 710077)

迷迭香酸干预下HBX基因对人肝癌细胞凋亡的影响*

苏杰 姚杨 朱星枚 成碧萍

(西安医学院附属医院中心实验室，陕西 西安 710077)

目的 研究迷迭香酸(Rosmarinic acid)对人肝癌HepG2细胞及稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2-X)增殖、侵袭力的影响，并探讨其可能的机制。方法 体外培养HepG2及HepG2-X细胞，加入不同浓度用迷迭香酸处理后，用MTT实验检测细胞增殖抑制率，用细胞划痕和Transwell小室法测定对细胞迁移力的影响。结果 不同浓度迷迭香酸均能够抑制HepG2、HepG2-X细胞的增殖，且呈时间和剂量依赖性，各HepG2-X组细胞A值均明显高于HepG2细胞(P<0.05)，显示HBX对HepG2细胞具有促进增殖作用。与对照组相比，实验组细胞划痕愈合减缓(P<0.05)，Transwell穿膜细胞数明显减少(P<0.05)。且呈浓度依赖性。结论 迷迭香酸能够抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移及侵袭力，HBx在迷迭香酸的干预下能促进HepG2细胞凋亡的作用。

肝癌细胞； HBx； 迷迭香酸； 增殖； 侵袭； 迁移

流行病学和分子生物学研究认为HBV是HBV相关性HCC发生的高危因素，HBx是HBV四个开放读码框架中X编码的一种病毒多功能蛋白，研究发现X基因表达产物(HBx)在肝癌形成过程中参与肝癌血管生成[1]，可能通过多种复杂的细胞信号转到途径参与细胞凋亡、DNA修复调控，促进细胞周期进程，与HCC的发生、发展具有密切的关系[2，3]。因此以HBx作为肝癌基因治疗靶点具有一定的临床应用前景。迷迭香酸(Rosmarinic acid,RosA)是一种水溶性的酚酸类化合物，在植物中广泛分布，尤以唇形科和紫草科含量最高。且具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肾小球细胞增殖、抗抑郁等多种药理作用[4,5]。在保肝、抗肿瘤等方面起着重要的作用，研究表明，其能显著抑制H2O2引起的大鼠红细胞溶血和脂质过氧化作用[6]，有效抑制金黄色葡萄球菌以及人体计生真菌活性[7]。但目前迷迭香酸对肝癌细胞的影响未见报道。因此，本文就迷迭香酸对体外培养的人肝癌HepG2细胞及稳定转染HBx基因的HepG2-X的侵袭、迁移及增殖的影响进行了探究，进一步探讨迷迭香酸的功能及其可能机制，另外，本文研究HBx在迷迭香酸干预下对HepG2细胞的影响，探讨HBx致肝细胞恶性转化的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌HepG2及HepG2-X细胞株由西安医学院附属医院中心实验室提供，迷迭香酸购自美国SIGMA公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解后-20℃保存，实验时用RPMI-1640培养基稀释。MTT和DMSO购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程研究所。

1.2 细胞培养 从液氮罐中取出冻存管，40℃水浴融化，1500r/min离心3min后弃上清；沉淀物用PRMI1640完全培养液混悬后适量培养液稀释，转入无菌培养瓶；在37℃、50Mm/L CO2、饱和湿度条件下的孵箱中培养；次日更换培养液，继续培养。每2d换液1次，待细胞铺满70%～80%培养瓶时，用2.5g/L的胰酶消化，完全培养基终止反应，滴管吹打为单个细胞，1∶4分瓶传代。选择对数生长期的细胞收集，在收集前1d换液1次，用胰酶消化为单个细胞悬液，离心，弃上清，加入冻存液，以1×106/mL的密度混悬细胞，将细胞悬液转至冻存管，标记好后置于4℃冰箱30min，转至-20℃冰箱2-3h，然后放入-80℃冰箱暂存，最后置于液氮罐中长期保存。

1.3 MTT法观察细胞增殖并测定迷迭香酸诱导细胞凋亡 实验分为迷迭香酸处理组和DMSO对照组(含0.02%的DMSO)将传代的HepG2细胞培养板中的原培养基吸出，分别加入溶于DMEM培养基中的迷迭香酸，其浓度为0(空白对照组)、10、20、40、80umol/L，终体积浓度为200μl。每个浓度设3个复孔，分别培养24、48、72h后，吸去孔内上清液，每孔加入150μl的二甲亚砜，振摇溶解结晶后酶联免疫检测仪于595nm波长处分别测定各孔吸光度(A)值，取其均数作为本次A值计数值。以时间为横轴，A值为纵轴绘制各组细胞生长曲线图，同样采用MTT法测定并计算细胞生长抑制率。

1.4 细胞体外侵袭试验 Matrigel胶4℃过夜融化，与无血清RPMI 1640培养基按1∶1比例稀释，以60μl/孔在Transwell上室进行铺胶，37℃放置于通风橱3h使其成胶。经不同浓度的迷迭香酸有处理细胞，胰蛋白酶消化，使细胞悬浮，经离心收集后用无血清RPMI 1640稀释成5×105个/ml，取200μl细胞悬液加入Transwell上室中，下室加入500μl含血清RPMI 1640培养液。常规条件下培养48h，取出Transwell小室，用棉棒擦净未穿透微孔滤膜的上室细胞，PBS漂洗1次，4%的多聚甲醛固定30min,PBS漂洗再次漂洗2次，Giemsa染色30min,双蒸水冲洗。取下微孔滤膜，置于倒置显微镜下随机选择5个视野，计算基底膜下细胞，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力，每组设3个复孔，重复4次。

1.5 划痕实验 将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液接种到6孔板，6孔板底部划好直线，调整细胞密度为2×105个/孔，摇匀后与37℃、5%CO2培养箱中常规培养过夜，待细胞贴壁后用1%血清培养基饥饿细胞24h,然后用灭菌的200ul微量移液枪枪头以直尺参照沿培养板底部呈I字形垂直划痕，划痕用PBS冲洗3次，以冲走划痕后的悬浮细胞，同时在实验组中分别加入用1.5%血清培养基配置的终浓度为100μmol/L的SFLLRN,对照组只加1.5%血清培养基。镜下记录划痕宽度并拍照。37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中继续培养24h，倒置显微镜下观察划痕愈合程度并拍照。

细胞制备细胞悬液，离心弃培养液， PBS洗1～2遍，用含0.1%FBS的DMEM培养基重悬细胞，将细胞密度调至于5。取200μl细胞悬液加入六孔板，36h后，用甲醛固定10min.0.1%结晶紫室温孵育10min,清水漂洗3遍以上，显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 不同浓度迷迭香酸对细胞增殖作用 MTT法检测各组细胞A值发现，HepG2-X细胞在24h、 48 和72h各时间点的A值均明显高于HepG2细胞(P<0.05)，表明HepG2-X细胞生长速度明显加快，显示HBx对HepG2细胞具有促进增殖作用。各组随迷迭香酸浓度的增加，所测得的A值逐渐降低，与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，迷迭香酸处理组作用各组细胞后，细胞增殖被明显抑制，随浓度的增加其抑制作用逐渐增强，迷迭香酸在浓度80umol/L时细胞增值抑制最为明显；不同浓度的迷迭香酸处理组作用后IR随着时间的增加而升高，各组较前时间点差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、表2，其抑制作用与时间及浓度呈明显正相关。

表1 迷迭香酸对HepG2-X细胞作用不同时间的A值

2.2 迷迭香酸可抑制肝癌细胞的侵袭迁移能力 通过Transwell体外侵袭实验研究发现，HepG2细胞具有较强的侵袭能力，迷迭香酸处理36h后，其侵袭能力明显减弱，与对照组相比，10、20、40、80umol/L迷迭香酸处理组与空白对照组相比穿过滤膜的HepG2细胞明显减少(P<0.05)；各处理组中不同浓度迷迭香酸作用后穿过滤膜的细胞数量随迷迭香酸浓度增加而减少，见图1。

表2 迷迭香酸对HepG2细胞作用不同时间的A值

2.3 迷迭香酸对肝癌细胞迁移的影响 各组细胞划线后在镜下视野均可见一条细长等宽的无细胞划痕区，36h后未经迷迭香酸处理过的对照组细胞运动迁移基本覆盖了大部分划痕区，随着迷迭香酸浓度的提高，细胞间划痕距离缩短趋势减缓，迷迭香酸对HepG2细胞迁移有明显的抑制作用，见图2。

图1 迷迭香酸对其侵袭能力的抑制

Figure 1 Inhibition of rosmarinic acid on invation

A:对照组；B:10μmol/L迷迭香酸组；C:20 μmol/L迷迭香酸组;D:40 μmol/L迷迭香酸组;E: 80μmol/L迷迭香酸组

图2 迷迭香酸对HepG2细胞迁移能力的影响

Figure 2 Influence of rosmarinic acid on cell migration

A :0h 对照组；B:36h 对照组；C:36h 10μmol/L迷迭香酸组；D: 36h 20 μmol/L迷迭香酸组E: 36h 40 μmol/L迷迭香酸组F: 36h 80μmol/L迷迭香酸组

3 讨论

我国每年约有11～13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。在诱发肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的众多因素中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染占到50%以上[8]。因此迫切需要寻找一种有效地临床治疗方法。迷迭香酸具有广泛的生物活性，近年来发现其对消化系统疾病有治疗和预防作用[9,11]。其通过何种环节发挥其作用目前还不清楚。本实验进一步探讨迷迭香酸对人肝癌HepG2细胞的影响，及HBx干预下对其影响，旨在为迷迭香酸应用于肝癌的临床治疗提供依据，以及将HBx作为肝癌基因治疗提供理论基础。

本实验通过Transwell侵袭小室模型在体外进行肿瘤细胞侵袭能力检测，观察到HepG2细胞具有较强的侵袭能力，加入迷迭香酸后，其侵袭能力明显减弱，呈浓度依赖性，说明迷迭香酸可抑制肝癌细胞的侵袭能力。划痕实验表明迷迭香酸能显著抑制肝癌HepG2细胞的迁移能力，且呈浓度依赖性。此外采用MTT检测HepG2-X细胞与HepG2细胞的增殖情况表明，迷迭香酸对两组细胞的生长活性具有抑制作用，其增殖抑制率与作用时间和剂量呈明显的相关性，随药物浓度增大作用时间延长，抑制率明显升高，且HBx具有促进肝癌细胞增殖的作用。

4 结论

迷迭香酸能够抑制肝癌细胞增殖。HBx在凋亡因子迷迭香酸的干预下能促进肝癌细胞的凋亡作用，但HBx与细胞凋亡的关系极其复杂。其对细胞凋亡具有双向调节作用，既可促进肝细胞凋亡同时可抑制肝细胞凋亡[12,13]。因此推测，HBx是促进还是抑制肝细胞凋亡可能与机体所处得环境因素有关。

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Effect of HBx gene on human HepG2 cell after rosmarinic acid intervention

SU Jie, YAO Yang, ZHU Xing-mei, et al

(TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anMedicalUniversity,Xi'an710077,China)

Objective To study the effect of rosmarinic acid on the proliferation and invasion on HepG2 and HepG2-X cell, and investigate the probable molecular mechanisms.Methods Different concentrations of rosmarinic acid were used to treat HepG2 and HepG2-X cell in vitro. The inhibition of proliferation of HepG2 and HepG2-X Cells were studied by methyl thiazolyl teerzolium(MTT) assay. The abilities of cell migration and invation were evaluated by wound healing adday and Transwell chambers. Results After Qucercetin treatment, the proliferation and invasion ability of HepG2 and HepG2-X cell were obviously decreased,which showed a dose-and time-dependent manner(P<0.05)，Absorbance in the HepG2- X group was obviously higher than that of HepG2 cells (P<0.05), showing HBx can promote the proliferation of HepG2.Conclusion Rosmarinic acid can inhibits the proliferation migration and invation of HepG2Cells in vitro. With the intervention of rosmarinic acid, The apoptosis of HepG2 Cells can be promoted by HBx.

Carcinoma; HBx; Rosmarinic acid; Proliferation ; Invasion; Migration

陕西省卫生厅科研资助项目(2012D17)

姚杨，E- mail:yaoyang1220@sina.com

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.006

2014-06-06； 编辑： 张文秀)