RET蛋白在先天性巨结肠肠壁中的表达

RET蛋白在先天性巨结肠肠壁中的表达

吴小红

(江苏大学附属宜兴市人民医院 胃肠外科, 江苏 宜兴, 214200)

关键词:先天性巨结肠; RET蛋白; Western-blot法

先天性巨结肠(HD)是小儿外科常见的消化道畸形疾病，主要以远端肠管肌间和黏膜下神经节细胞缺如并以及此节段的持续性收缩为特征。目前，对其确切病因尚不清楚，导致狭窄段神经节细胞缺如的原因概括起来大致有3种: ① 消化管神经嵴细胞迁移障碍; ② 肠管微环境因素阻止神经节细胞的正常发育; ③ 遗传因素的影响[1]。当今国内外对先天性巨结肠的病因有较多研究，已发现有5种致病基因，其中RET原癌基因是其主要的致病基因。目前，国内外已对RET基因及其表达产物进行了相应的研究，但都停留在免疫组化水平。本文运用Western-blot技术检测RET蛋白在散发性HD肠壁中的表达，进步了解HD在分子基础上的发病机制，为临床提供参考。

1资料与方法

1.1　一般资料

收集本院2004年11月—2009年10月手术切除的经病理诊断为HD的病变段结肠标本16例为实验组，分别取狭窄段、移行段、扩张段全层肠壁组织，用无菌生理盐水冲洗表面污垢后，立即送-80 ℃恒温冰箱中保存。16例患儿中，男9例，女7例；年龄16 d～14岁，中位年龄7岁；其中新生儿2例，1个月～9岁12例，14岁2例，长段型4例，普通型5例，短段型7例。所有患者均为散发性，无家族史，无合并其他主要脏器的先天性畸形或综合征。同时，随机选取16例非巨结肠手术患儿为对照组，年龄8 d～6岁，男女比例1∶1。其中肛门直肠畸形5例(肛门闭锁2例、直肠闭锁3例)，均行结肠造瘘术，肠套叠行肠吻合术7例，关瘘术4例。取造瘘口处肠壁，并经病检存在神经节细胞。

1.2　方法

采用Western-blot分析测定，根据Bradford法测定样本胞膜蛋白浓度后，取一定量的胞膜蛋白溶液，用5×电泳加样缓冲液将胞膜蛋白裂解液稀释成5 μg/μL的溶液100 μL, 95 ℃水浴5 min后，在-80 ℃温度下保存备用。实验时，取10 μL的胞膜蛋白裂解溶液(含等量蛋白50 μg)电泳转膜。10%牛血清封闭1h后，加山羊抗人RET单克隆抗体一抗(Santa cruz公司产品, 1∶400), 4 ℃孵育过夜。PBS冲洗膜3遍后，加驴抗山羊二抗(碧云天生物技术研究所产品，浓度为1∶2 000), 室温孵育1 h后, PBS冲洗膜3遍，用DAB显色试剂显色。用Image J分析软件测定条带的灰度值，用GAPDH条带的灰度值作内对照进行校正，分别计算出各样本的相对表达量。

2结果

2.1　Western-blot法定性及半定量分析

RET蛋白在HD患儿痉挛段表达减少，在移行段、扩张段、对照组的表达无明显变化。

2.2　RET蛋白在痉挛段、移行段、扩张段和

对照组结肠肠壁的表达

痉挛段分别与移行段、扩张段和对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05); 移行段、扩张段、对照组之间相互比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　RET蛋白在痉挛段、移行段、扩张段和

与其他组比较, **P<0.01。

3讨论

HD主要病变为肠道末端一段肠壁的肠神经丛神经节细胞缺失，受累肠段持续异常收缩，其上段结肠仍然保持蠕动功能，结果导致代偿性扩张、肥厚，最终形成巨结肠，又称无神经节细胞症。诊断通常结合主要症状、结肠的放射学表现、直肠测压以及直肠活组织检测的组织学特征，典型的组织学特征包括神经节细胞缺失和粗大的神经干[2]。目前研究已表明，HD是一种多基因控制的疾病，一些基因的缺失或突变可导致微环境变化，引起肠神经母细胞(神经嵴胚细胞)迁移的停顿而导致HD。文献[3]报道先天性巨结肠的病因可能与原癌基因RET、血内皮素B受体基因(EDNRB)及其配基血管内皮素-3基因(EDN3)有关。

RET原癌基因作为HD的主要致病基因，定位于染色体10q11.2, 全长约80 kb, 编码酪氨酸激酶受体，它具有20个外显子[4]。RET原癌基因的表达产物RET蛋白(酪氨酸激酶受体)由3部分组成：细胞外链条联结区、跨膜区、细胞内酪氨酸激酶区，它具有对细胞生长和分化转导信号的机理，即：细胞外因子与该受体结合，促使受体形成二聚体，接着，受体构型发生变化，激活膜内区的酪氨酸激酶，使得受体自身磷酸化。同时，使底物的酪氨酸激酶磷酸化，这样信号就通过受体进入到细胞内，再进一步传递给效应子、传递子或联接子，从而影响细胞的生理活动、生长发育[5]。

RET原癌基因作为HD的致病基因，已被许多实验所证实, Schuchardt A等[6]利用基因工程技术剔除RET基因，制备RET纯合子缺失的鼠，组织学发现该鼠全部消化道神经节细胞缺如。Pachnis V等[7]发现当神经节细胞RET蛋白表达量减少一半时，节细胞就不能移行到肠壁内。对HD扩张段、移行段、狭窄段行RET基因表达研究，发现其表达是扩张段、移行段、狭窄段逐渐下降的[8-9]。由于RET基因的表达在建立肠神经丛中占重要的地位，其在神经节细胞缺如肠段的表达减少很可能暗示为神经嵴细胞的一种发育停滞。国内外对家族性、散发性HD进行RET基因突变研究[10-11]，均发现有RET基因突变，导致所在区域的氨基酸发生改变，当前已初步明确HD与RET原癌基因的具体联系：家族性HDRET基因的突变位点均是RET蛋白产物的细胞外区段的编码区，而散发性HDRET基因突变位点均是RET蛋白产物的细胞内区段的编码区[12]。通过对RET蛋白在非HD患儿和非症状的HD患儿结肠中的表达研究发现，RET蛋白在正常对照组的每个样本都有表达，表明RET在胚胎发育之后的成熟肠神经系统有一定的作用。另外，RET在所有肠管中均有表达，可证实RET基因与整个肠神经系统的正常发育和功能有关，而RET蛋白在非症状的HD患儿结肠扩张段、移行段、痉挛段逐渐减少，且扩张段、移行段和正常(非HD患儿)结肠平滑肌组织中的表达无显著差异，这种异常分布可能与肠神经系统的发育异常引起RET基因突变，从而引起RET蛋白表达减少有关。

另外，实验还发现，RET蛋白在HD患儿无神经节细胞肠管中的表达显著减少，可能是由于远端结肠内能表达RET蛋白的固有神经节细胞缺乏，表明RET基因可能是维持正常肠神经系统功能的必要基因，具体表现是：RET蛋白表达减少，引起肠管痉挛、肠腔狭窄，造成功能障碍，但是否引起肠神经节细胞缺乏等尚有待进一步研究。这些结果都与国内相关研究机构的研究相一致。

参考文献

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[7]Pachnis V, Mankoo Bs, Costantini F. Expression of c-ret proto-oncogene during mouse embryo genesis[J]. Development, 1993, 119: 1005.

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[11]许娟, 魏明发, 史慧芬, 等. 先天性巨结肠RET基因突变的研究[J]. 中华小儿外科杂志, 1999, 20(1): 78.

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收稿日期:2014-12-08

中图分类号:R 574.62

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-164-02

DOI:10.7619/jcmp.201509055