重庆地区膀胱癌人群IL-23R rs10889677位点单核苷酸多态性与膀胱癌易感性的相关性分析

曹全富, 叶　锦, 付成伟, 冯庆兴, 张　军, 张克勤

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所 泌尿外科, 重庆, 400042)

重庆地区膀胱癌人群IL-23R rs10889677位点单核苷酸多态性与膀胱癌易感性的相关性分析

曹全富, 叶锦, 付成伟, 冯庆兴, 张军, 张克勤

(第三军医大学大坪医院野战外科研究所 泌尿外科, 重庆, 400042)

摘要:目的分析白介素23受体(IL-23R)基因rs10889677位点单核苷酸多态性(SNPs)与重庆地区膀胱癌人群易感性的相关性。方法选取来自重庆地区的膀胱癌组患者210例和健康对照组人群200例，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测IL-23R rsl10889677位点SNPs并分析其与膀胱癌的关系。结果IL-23R基因rs10889677位点存在三种基因型(AA型、AC型和CC型)，在膀胱癌组和对照组中的基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=17.45,P<0.01); 膀胱癌组携带等位基因A的频率(75.71%)明显增高对照组基因型(65.50%), 差异有统计学意义[χ2=19.28,P<0.01, OR=1.952, 95%CI(1.451～2.620)]。结论IL-23R rs10889677位点基因多态性与重庆地区膀胱癌易感性相关。

关键词:白介素-23受体; 单核苷酸多态性; 易感性; 相关性; 膀胱癌

膀胱癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发病率为中国泌尿系肿瘤第一位，且有逐年增长趋势[1]。国内外研究[2-3]证实慢性炎症与恶性肿瘤的发生密切相关，二者在多方面具有相似性，如免疫细胞浸润、基质金属蛋白酶活性升高、血管增生和脉管系统密度提高[4]。白介素23受体(IL-23R)基因是与炎症、肿瘤等疾病发病相关的细胞因子[5]。但IL-23R基因rs10889677位点SNPs是否与重庆地区膀胱癌人群发病有关尚不明确，故本研究将采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对IL-23R基因rs10889677位点进行SNPs检测并分析该位点SNPs与重庆地区人群膀胱癌的相关性，为探索IL-23R基因与膀胱癌的发病机制提供理论依据。

1资料与方法

选择2010年10月—2013年5月年本院泌尿外科收治的重庆地区210例膀胱癌患者为病例组，经病理确诊。其中男158例，女52例，平均年龄(64.5±10.5)岁，吸烟者92例，不吸烟者118例；上述病例均为初诊膀胱癌患者，不包括膀胱癌复发患者，未经化疗、放疗，并且无任何其他肿瘤病史；肿瘤组织病理诊断为膀胱移行细胞癌，其中浅表性(Ta期～T1期)为148例，浸润性(T2期～T4期)为62例。对照组200例，来自本院同期健康体检者，其中男116例，女84例，平均年龄(62.7±9.5)岁，吸烟者74例，不吸烟者126例，无慢性疾病、无泌尿系统疾病、无任何恶性肿瘤家族史，最终排除诊断膀胱肿瘤及其他部位恶性肿瘤。上述2组研究对象均未接受其他免疫抑制剂治疗，未合并其他自身免疫性疾病、病毒性肝炎和HIV感染。全部研究对象经本院伦理委员会同意，签署知情同意书。

PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成，Dream TaqTM Green PCR Master Mix(2x)、限制性内切酶均购自美国Fermentas公司，MarkerDP500TM为大连宝生物生物工程有限公司生产。主要仪器有PCR扩增仪为德国Eppendorf公司产品，高速低温离心机购自德国Eppendorf公司，电泳仪产自北京六一仪器厂，全自动凝胶成像仪购自美国SYNGENE公司。

采集研究对象外周血2 mL(血常规管抗凝)，采用全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，按说明书操作，在紫外分光光度仪上(OD260/OD280)进行核酸定量，最后将提取的DNA稀释至20 ng/μL, -20 ℃保存待用。

rs10889677的PCR引物参照文献[6]设计，由上海生工公司合成。rs10889677位点PCR引物序列为F: 5′-CTGTGCTCCTACCATCACCA-3′, R: 5′-TGCTGTTTTTGTGCCTGTATG-3′。25 μL PCR反应体系包括DNA 20 μL, 上下游引物(1.0 μmol/L)各1 μL, Dream TaqTM PCR Master Mix(2×)12.5 μL, 灭菌去离子水8.5 μL。PCR反应为先95 ℃ 2 min, 接着95 ℃ 20 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环，最后72 ℃ 10 min。PCR扩增产物用DraI限制性酶37 ℃酶切过夜, 20 μL反应体系包括PCR产物10 μL、限制性内切酶(10 U/μL) 1 μL, 反应缓冲液2 μL, 灭菌去离子水7 μL。酶切产物用3 g/dl琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶电泳成像分析系统观察、判定基因型。

根据已知的引物对能否扩增目的片段，来确定该等位基因的存在与否，即分别经不同的引物对扩增2次后，PCR产物经电泳确定基因型；为了提高PCR-RFLP方法的准确性，随机抽取10%标本，送上海生工进行测序验证，结果吻合。

2结果

2.1　一般资料

2组的性别、年龄、体质量、BMI、吸烟状态差异均无统计学意义(P均>0.05), 具有可比性。见表1。

表1　2组一般资料比较

2.2　IL-23R rs10889677位点多态性与膀胱癌发病相关性分析

经卡方检验，膀胱癌组与对照组中rs10889677位点基因型和基因频率具有显著差异(P<0.01); 膀胱癌携带等位基因A的频率(75.71%)明显增高对照组基因型(65.50%), 差异有统计学意义[χ2=19.28,P<0.01, OR=1.952, 95%CI(1.451～2.620)]。见表2。

表2　IL-23R rs10889677位点基因型及等位基因

3讨论

目前越来越多的研究证实慢性炎症是肿瘤发生的病理基础。慢性炎症促进细胞增殖，其中在富含炎性细胞、生长因子和DNA损伤诱导剂的微环境中更可以明显增加癌症发病的风险[7]。炎性因子、生长因子、炎症趋化因子、活性氧(ROS)和环氧合酶2(COX2)的相互作用，在炎症发生发展的中以一种复杂的方式发挥交互作用[8]。膀胱癌是遗传因素和环境因素长期共同作用的结果，慢性炎症可能作为膀胱癌发生的危险因素也已得到证实[9]。IL-23R是一个新的促红细胞生成素受体家族成员，由IL-11和IL-23R两个亚基构成[10]。IL-23通过结合细胞膜表面 IL-23R复合物发挥其生物效应，刺激细胞内信号传导系统来诱导细胞激活。IL-23有促炎症反应活性，通过STAT3信号通路激活并刺激记忆性CD4+T细胞增殖，趋化炎症细胞聚集与迁移，在多种炎症病灶中都有p40和p19mRNA高表达[11]。IL-23可以诱导激活的CD4+记忆T细胞产生IFN-7; 也能激发树突状细胞和单核细胞产生IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)，参与先天性免疫反应；并能刺激树突状细胞自分泌产生IL-12[12]。而IL-12只激活Th0细胞(幼稚T细胞)和自然杀伤细胞产生以IFN-γ为主的细胞因子[13]。IL-23诱导的炎症反应过程如血管生成和巨噬细胞、中性粒细胞的浸润是细菌感染的有效防御机制[5]。但是这个调节通路似乎对于肿瘤的预防并不合适，反而为肿瘤提供了一个保护性环境。

本研究首次探讨了重庆地区膀胱癌人群IL-23R基因rs10889677位点多态性与膀胱癌遗传易感性的关系。研究发现IL-23R rs10889677基因型可增加膀胱癌的患病风险。此外，作者也观察到携带等位基因A的人群更倾向性于患有膀胱癌。基因序列中单个核苷酸的替代、插入或缺失，都会引起编码氨基酸的改变或导致转录的mRNA剪接的改变，影响基因表达与蛋白质的功能从而导致疾病的发生。IL-23Rrs10889677单核苷酸多态性可能促使受体的过表达，IL-23R与蛋白酪氨酸激酶(JK2)相连，同时也促进信号转导和转录激活子(STAT3)以配体依赖方式结合，使其磷酸化和随之而来的二聚化，触发下游基因的表达，如IL-17及IL-22[14]。IL-23R可诱导幼稚的CD4+T细胞向Thl7细胞亚群分化[15], Thl7细胞在受到刺激后可高表达IL-17, 有利于病原体的清除组织炎症。IL-17是一个强促炎症细胞因子，组织中过量表达的IL-17会引起慢性炎症反应与组织损伤[16]。因此, IL-23R可能促进炎症、癌症的患病风险[17-18]。全基因组研究发现，rs10889677与口腔癌[19]、乳腺癌[20]和卵巢癌[2]的发生有密切关系。此外, IL-23R基因多态性与食管癌、胃癌等的研究已证实IL-23R可能与某些炎症相关的肿瘤易感性有关。Zhang等[2]研究发现, IL-23R可通过交替剪接产生剪接异构体，并优先在肺癌中表达，进而推测该表达可能有助于细胞逃避机体的免疫监视或攻击，使IL-23R可能在某些癌症的发生、发展过程中发挥作用。Chen和Hsich[21]的研究证实，IL-23R信号通路中STAT3调控多种与细胞增殖及凋亡有关的功能蛋白的表达，STAT3的异常活化是引起某些癌症的原因之一。所有这些发现表明，rs10889677的单核苷酸多态性可能有助于IL-23信号通路的调节并最终导致易感某些疾病。尽管如此，IL-23R的单核苷酸多态性和IL-23R的转录和表达还需待进一步研究。

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Analysis in correlation between polymorphism of

IL-23R gene rs10889677 and susceptibility

of bladder cancer in Chongqing area

CAO Quanfu, YE Jin, FU Chengwei, FENG Qingxing, ZHANG Jun, ZHANG Keqin

(DepartmentofUrinarySurgery,DapingHospitalofTheThirdMilitaryMedical

University,Chongqing, 400042)

ABSTRACT:ObjectiveTo analyze the correlation between the polymorphism of IL-23R gene rs10889677 SNPs and susceptibility of bladder cancer in Chongqing area. MethodsA total of 210 bladder cancer patients (bladder cancer group) and 200 healthy people (control group) were selected. The rs10889677 SNPs was analyzed by restriction fragment length poly(PCR-RFLP), and its relationship with bladder cancer was analyzed as well．ResultsThere were three kinds of genotypes in IL-23R gene rs10889677 (AA, AC and CC). In the three single nucleotide polymorphisms of IL-23R, the distributions of genotype and allele frequencies of rs10889677 differed significantly between the bladder cancer group and the control group. The frequency of allele A of rs10889677 in the bladder cancer group was 75.71%, which was significantly higher than 65.50% in the control group, and there was significant difference [χ2=19.28,P<0.01, odds ratio=1.952, 95% confidence interval (1.451～2.620)]. ConclusionThe rs10889677 of IL-23R gene is associated with susceptibility of bladder cancer in Chongqing area.

KEYWORDS:interleukin 23 receptor; single nucleotide polymorphisms; susceptibility; correlation; bladder cancer

通信作者:叶锦, Email: yejin7566@hotmail.com

收稿日期:2015-01-11

中图分类号:R 737.14

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-073-03

DOI:10.7619/jcmp.201509021