EGFR及Mfn2在乳腺癌进展中的意义及其相关性研究

张顺礼, 胡继卫, 马　杰, 张景华, 王　宇, 谷　峥, 陈晶晶

(1. 河北省唐山市人民医院 乳腺外科, 河北 唐山, 063001; 2. 云南中医学院临床医学院, 云南 昆明, 650000)

EGFR及Mfn2在乳腺癌进展中的意义及其相关性研究

张顺礼1, 2, 胡继卫1, 马杰1, 张景华1, 王宇1, 谷峥1, 陈晶晶1

(1. 河北省唐山市人民医院 乳腺外科, 河北 唐山, 063001; 2. 云南中医学院临床医学院, 云南 昆明, 650000)

摘要:目的研究外周血线粒体融合蛋白2(Mfn2)在表皮生长因子受体(EGFR)为阳性的乳腺癌患者疾病进展中的表达情况，探讨其与EGFR及乳腺癌预后的关系。方法选择EGFR阳性乳腺癌患者44例，检测其外周血Mfn2 mRNA表达。随访3年出现疾病进展时，再次检测患者外周血Mfn2 mRNA表达情况。结果26例患者出现疾病进展，外周血Mfn2阳性表达组疾病进展率为42.1%(8/19), 阴性组疾病进展率为72.0%(18/25), 差异具有统计学意义(P<0.05); 疾病进展后，阳性组Mfn2阳性率降至52.63%(10/19), 阴性组阳性表达率为0%; 阳性组出现疾病进展患者阳性率为25.00%(2/8), 未进展患者阳性率72.72%(8/11), 差异具有统计学意义(P<0.05)。结论EGFR、Mfn2在乳腺癌的复发、转移中发挥重要作用，联合检测EGFR、Mfn2可能作为监测乳腺癌进展、提高乳腺癌复发的诊断效率及预测肿瘤预后的重要生物学指标。

关键词:乳腺癌; 表皮生长因子受体; 线粒体融合蛋白-2; 免疫组织化学; 逆转录-聚合酶链反应

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有57万例乳腺癌患者发生远处转移[1]。乳腺癌的发生主要涉及癌基因的激活与抑癌基因的失活。中国学者陈光慧[2]等研究发现线粒体融合蛋白2(Mfn2)是一种重要的细胞增殖抑制因子，也称为细胞增殖抑制基因(HSG)。研究认为Mfn2可能是一种高效的抑癌基因[3], Mfn2表达异常或功能缺失可能是肿瘤发生发展的重要原因[4]。表皮生长因子受体(EGFR)的过度表达与肿瘤的转移和血管形成有关[5]。本研究组前期研究发现EGFR阳性患者中Mfn2 mRNA的表达率显著低于EGFR阴性者[6]。为进一步研究二者与疾病进展的关系，本研究选取青年乳腺癌EGFR阳性表达者，分析患者疾病进展过程中外周血Mfn2表达情况，探讨EGFR与Mfn2在乳腺浸润性导管癌患者的疾病发生发展中可能的作用及临床意义，报告如下。

1资料与方法

选择2011年1月—2011年10月在唐山市人民医院进行诊断、治疗的所有乳腺癌患者的临床资料进行统计，入选标准: ① 年龄30～35岁，体质量指数20～24.9，已婚; ② 临床资料完整，有手术病历，根据国际抗癌协会乳腺癌TNM分期: Ⅲ期; ③ 病理诊断为浸润性导管癌明确，并行免疫组化雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)等相关基因检测均为阴性; ④ 无其他基础疾病，所有患者术前未接受化疗、放疗。免疫组织化学法检测乳腺癌组织，筛选出符合上述标准的EGFR阳性表达患者44例。根据手术及放化疗治疗后外周血中Mfn2的表达情况分为Mfn2阳性表达组19例及阴性表达组25例，随访3年，每3个月随访1次。

PCR引物：引物的设计及合成由上海生工北京测序部负责完成。引物序列如下: Mfn2引物上游5′-AGGGACTTGCCTCTCTTCTC-3′, 下游5′-TCCACCATCCATCCTTCTAC-3′; HGADPH引物上游5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′, 下游5′-TGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3′。

总RNA提取：分别采集患者放化疗结束后及随访结束后(或出现疾病进展后)静脉血液标本3～5 mL，EDTA管抗凝。人淋巴细胞分离液分离有核细胞，采用TRNzol试剂按说明书操作，经氯仿分层，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，提取总RNA。2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度计测定其浓度和纯度。

cDNA合成：取总RNA2 μL, 根据逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应条件: 1 g/L模板总RNA 2 μL, 0.5 g/L Oligo(dT) 181 μL, RNasefree ddH2O 9 μL, 70 ℃水浴5 min, 冰浴30 s, 再于试管内加入5倍Reaction Buffer 4 μL, RNase Inhibitor 1 μL, dNTP Mix 2 μL, 反应混合物于37 ℃水浴5 min, 最后加入1 μL MMuLV RT(200 U/μL), 终体积为20 μL, 42 ℃水浴60 min, 70 ℃加热10 min结束反应，-20 ℃冷冻保存。

PCR扩增：取第一链cDNA 2.0 μL按PCR试剂盒组建反应，反应体系总体积25 μL。第一链cDNA 2.0 μL, 10 μmol上游引物1 μL, 10 μmol下游引物1 μL, 2倍PCR Master Mix 12.5 μL, ddH2O 8.5 μL。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下照相。

所有患者进行定期随访，RT-PCR法检测疾病进展前后外周血Mfn2 mRNA的表达，比较外周血Mfn2阳性组、阴性组疾病进展率及疾病进展前后Mfn2阳性表达率变化。

2结果

2.1　RT-PCR检测Mfn2 mRNA表达

HGADPH产物为296 bp，Mfn2的PCR产物琼脂糖凝胶电泳可见大小约143 bp左右的特异性条带，见图1, 符合目的基因片段大小。

注:1.DNAmarker;2.外周血Mfn2mRNA阳性表达图1 PCR扩增后Mfn2mRNA的表达

2.2　外周血Mfn2阳性组及阴性组疾病进展率比较

至2014年10月，共26例乳腺癌患者疾病临床证实远处转移或局部复发，外周血Mfn2阳性表达组疾病进展率为42.1%(8/19), 阴性组疾病进展率为72.0%(18/25), 差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3　疾病进展后2组患者Mfn2阳性表达率比较

在限定除外其他相关因素影响下，疾病进展后，阳性组Mfn2阳性率降至52.63%(10/19), 阴性组阳性表达率为0; 阳性组发生疾病进展患者Mfn2阳性率为25.00%(2/8), 未进展患者阳性率72.72%(8/11), 差异具有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

乳腺癌的发生是一个复杂的多因素、多步骤的病理生理过程[7-8]。青年乳腺癌具有发展快、侵袭性高、预后差等特点[9]。有文献报道Mfn2在乳腺癌组织中的表达水平较正常组织降低，Mfn2低表达可能与乳腺癌的发生有关，且通过下调Mfn2表达量可能会增加乳腺癌患病风险[10]。研究发现Mfn2表达异常或功能缺失可能是肿瘤发生的重要原因[11]。随着Mfn2抑制细胞增殖作用的发现，人们开始关注它在抗肿瘤方面发挥的作用[12]。付玉环等[13]研究发现乳腺癌Mfn2表达率较癌旁正常乳腺下降，且乳腺癌Mfn2表达与组织学分级、淋巴结转移和雌激素受体有关，可作为判断乳腺癌生物学行为的良好指标。EGFR及其配体EGF可启动Ras-Raf-MAPK信号转导途径，其对细胞生长、增殖、发育分化及癌细胞产生起重要作用,EGFR高表达会促进肿瘤细胞的增殖、黏附、转移以及血管生成，抑制肿瘤细胞的凋亡，进而促进肿瘤的进展，而该途径可被Mfn2抑制，导致EGFR表达下调[15]。Ratchford等[14]研究指出EGFR高表达的肿瘤患者易发生转移，且复发率高、存活期短。

本研究组前期研究结果显示乳腺癌EGFR阳性患者Mfn2表达率显著低于EGFR阴性者，故本研究通过入组筛选，选择EGFR受体阳性乳腺癌患者，降低或去除其他多因素的影响,定期随访其3年内疾病进展情况，结果显示，乳腺癌组织EGFR受体阳性情况下，外周血Mfn2表达阴性组疾病进展率显著高于外周血中Mfn2表达阳性组，与文献报道一致[16], 疾病进展后，阳性组Mfn2阳性率降低，阳性组疾病进展患者阳性率明显低于未进展患者阳性率。分析认为，EGFR的高表达可能会引起Mfn2表达异常或功能缺失，从而引起随访3年后乳腺患者疾病进展后的外周血Mfn2 mRNA的阳性表达率下降，而外周血Mfn2阳性表达一定程度上可抑制EGFR及其配体EGF启动信号转导途径，从而使EGFR表达下调，在一定程度上减缓肿瘤进展。

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Significance and the relevance study of EGFR

and Mfn2 in the progression of breast cancer

ZHANG Shunli1, 2, HU Jiwei1, MA Jie1, ZHANG Jinghua1, WANG Yu1,

GU Zheng1, CHEN Jingjing1

(1.DepartmentofBreastCancer,TangshanPeople′sHospital,Tangshan,Hebei, 063001;

2.SchoolofClinicalMedicine,YunnanUniversityofTCM,Kunming,Yunnan, 650000)

ABSTRACT:ObjectiveTo study the expression of peripheral blood Mitochondria fusion protein-2 (Mfn2) in the disease progression of breast cancer patients with positive epidermal growth factor receptor (EGFR) and to explore its relationship with EGFR and the prognosis of patients with breast cancer. MethodsEGFR expression in the cancerous tissue of patients with breast cancer was detected by histoimmunochemical method, in which 44 patients with positive expression of EGFR were selected. The expression of peripheral blood mfn2 mRNA was detected, which was re-detected when disease progressed after 3 years-follow-up. ResultsOf all patients, 26 patients had disease progression. The disease progression rates in positive and negative expression groups of peripheral blood Mfn2 were 42.1% (8/19) and 72.0% (18/25), respectively, and the difference was significant (P<0.05). After disease progression, the positive expression rates of Mfn2 in positive and negative expression groups decreased to 52.63% (10/19) and 0%. And the positive rates of patients with disease progression in positive expression group and non-disease progression group were 25.00% (2/8) and 72.72% (8/11), respectively, and the differences were significant (P<0.05). ConclusionEGFR and Mfn2 play an important role in the recurrence and metastasis of breast cancer, and their joint detection can be used as an critical biological marker for the surveillance of disease progression and promote the diagnostic rate of the recurrence and the prognosis of breast cancer.

KEYWORDS:breast cancer; epidermal growth factor receptor; Mitochondria fusion protein-2; histoimmunochemical method; reverse transcription-polymerase chain reaction

通信作者:张景华, E-mail: jhzh2010@163.com

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11321419)

收稿日期:2014-12-25

中图分类号:R 737.9

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-059-03

DOI:10.7619/jcmp.201509017