β-咔啉类生物碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

樊玉祥, 曾凡业, 张洪亮

(新疆医科大学附属中医医院 肿瘤科, 新疆 乌鲁木齐, 830000)

β-咔啉类生物碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

樊玉祥, 曾凡业, 张洪亮

(新疆医科大学附属中医医院 肿瘤科, 新疆 乌鲁木齐, 830000)

摘要:目的观察β-咔啉类生物碱对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法不同浓度β-咔啉类生物碱处理人胃癌SGC-7901细胞48 h后，检测细胞增殖、凋亡情况，并以荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)分别测定细胞中抑癌基因PTEN、蛋白激酶B(AKT)基因mRNA及其蛋白表达。结果不同浓度的β-咔啉类生物碱均能抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖，其中40 μg/mL浓度的抑制效果较其他浓度及5-Fu干预组更显著(P<0.01), 并可诱导细胞凋亡。不同浓度β-咔啉类生物均可引起PTEN mRNA和蛋白表达增加, AKT mRNA和蛋白表达减少，其中40 μg/mL浓度的调节效果较其他浓度及5-Fu干预组更显著(P<0.01)。结论β-咔啉类生物碱可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，诱导凋亡，其作用机制可能是通过上调PTEN及下调AKT蛋白的表达实现。

关键词:β-咔啉类生物碱; 人胃癌SGC-7901细胞; 抑癌基因PTEN; 蛋白激酶B; 细胞凋亡

β-咔啉类生物碱是从新疆地产药材骆驼蓬种子中所提取出的生物碱，国内研究发现β-咔啉类生物碱有较广的抗肿瘤谱，且毒副作用小[1-3]。目前虽有骆驼蓬的粗提取物应用于临床肿瘤的治疗，但其抗肿瘤机制尚未阐明。PTEN于1997年被克隆并命名，其编码的蛋白在胞浆中表现出双重特异性磷酸酶活性，是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞迁移过程起关键性作用[4]。蛋白激酶B(AKT)与人类病毒癌基因v-AKT高度同源，研究表明其在早、中、晚期胃癌组织中的表达水平均较正常胃黏膜组织高[5]。本实验通过观察β-咔啉类生物碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖作用的影响及凋亡的过程，从而探讨β-咔啉类生物碱体外抗肿瘤的机制。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1主要试剂: β-咔啉类生物碱(北京中医药大学刘永刚教授惠赠), CCK-8溶液(碧云天生物技术研究所)，DNA Ladder抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所), Hoechst 33258染色液(碧云天生物技术研究所)，即用型细胞和组织总RNA提取试剂(英国Invitrogen公司)，琼脂糖(上海生工生物工程技术服务有限公司)，高灵敏度飞克级化学发光液Super Signal West Prico Chemiluminescent Substrate(美国Thermo Scientific公司), BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京生化科技有限公司)，β-actin(英国abcam公司)，蛋白预染Marker(美国Thermo Scientific公司)，山羊抗兔IgG抗体，过氧化酶抑制物(美国Thermo Scientific公司), AKT蛋白抗体(英国abcam公司)，PTEN蛋白抗体(英国abcam公司)，Chemiscope 3000化学发光成像仪系统(上海勤翔科学仪器有限公司)，蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.1.2细胞来源：人胃癌SGC-7901细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。常规培养于含10%胚胎牛血清培养液中，置于5% CO2、37 ℃的孵育箱中培养及传代。

1.2　细胞活性的检测

取对数生长期SGC7901细胞，96孔板中加入RPMI-1640培养液，配制 5×104个/mL浓度的细胞悬液200 μL/孔, 37 ℃、5% CO2培养24 h 贴壁；后加入200 μL不同浓度(0、10、20、40 μg/ mL)的β-咔啉类生物碱与5 μg/mL阳性对照药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)，每组5个重复, 37 ℃共培养48 h, 按照CCK-8说明书检测细胞活性。

1.3　细胞凋亡的检测

1.3.1Hoechst 33258荧光染色法：取1 mL处于对数生长期的SGC-7901细胞，按1×106个/mL的浓度接种25 cm2的细胞培养瓶内。常规培养24 h后，以不同浓度的β-咔啉类生物碱(0、20、40 μg/mL)与40 μg/mL阳性对照药物5-Fu分别干预48 h后终止培养。以0.25%胰酶消化细胞, 1 200 r/min的速度离心5 min, 用PBS缓冲液洗涤并悬浮细胞，取一滴悬液于载玻片上吹散，加3∶1甲醇/冰醋酸固定液固定10 min, 自然晾干后加入5 mg/L荧光染液Hochest33258避光染色45 min, 再用双蒸水洗3次，自然晾干，置于正置荧光显微镜下观察并拍摄。

1.3.2DNA Ladder法：不同浓度药物干预48 h后收集细胞，按DNA Ladder 提取试剂盒说明书提取细胞DNA, 1.2%的琼脂糖凝胶、100 V、25 min条件电泳，观察凋亡梯状条带。

1.4　PTEN mRNA与AKT mRNA的检测

不同浓度药物干预48 h后收集细胞，按照Trizol试剂盒说明书操作，提取总RNA。并检测RNA浓度, A260/A280, 电泳检测RNA完整性以合成cDNA。PTEN上游引物5′-TTTGAAGACCATAACCCACC-3′, 下游引物5′-ATTACACCAGTTCGTCCCTT-3′, 扩增产物134 bp, AKT上游引物5′-GTCATCGAACGCACCTTCCA-3′, 下游引物5′-AGCTTCAGGTACTCAAACTC-3′, 扩增产物218 bp。以β-actin为内参，计算表达量。

1.5　PTEN和AKT蛋白表达的检测

不同浓度药物干预48 h后收集细胞，经液氮研磨后加入500 μL RIPA裂解液，充分混匀，冰上放置30 min后匀浆器匀浆，冰上放置30 min, 12 000 r/min的速度在4 ℃条件下离心15 min, 收集上清，加入5×SDS-PAGE loading buffer，沸水加热处理5 min, 使蛋白充分变性, 4 ℃条件下, 12 000 r/min的速度离心10 min，取上清备用。BCA法测定总蛋白浓度，用ECL ChemiScope 3000化学发光仪检测、拍照，计算目的蛋白的积分光密度值，以β-actin为内参，计算其表达丰度。

1.6　观察指标

观察不同浓度β-咔啉类生物碱对SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响，及不同浓度下PTEN mRNA、AKT mRNA及蛋白的表达水平差异。

2结果

2.1　β-咔啉类生物碱对SGC-7901细胞增殖的影响

除48 h时10 μg/mL浓度β-咔啉类生物碱干预下的OD值与阴性对照组无显著差异外(P>0.05), 其余各时间点及不同浓度β-咔啉类生物碱干预下的细胞OD值均低于阴性对照组，5-Fu干预组也低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。24 h时，随药物浓度增加，OD值逐渐降低，两两比较差异有统计学意义(P<0.01), 5-Fu干预组低于10、20 μg/mL浓度(P<0.01)，高于40 μg/mL浓度(P<0.01); 48 h时, 40 μg/mL浓度药物干预下的OD值低于其他2组(P<0.01)，而10 μg/mL和20 μg/mL浓度之间差异无统计学意义(P>0.05), 5-Fu干预组高于40 μg/mL浓度(P<0.01), 与其他浓度无统计学差异(P>0.05)。此外，阴性对照组及不同药物浓度下的OD值在48 h时均较24 h降低，差异有显著意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

浓度/(μg/mL)24hOD值48hOD值01.85±0.291.39±0.22▲101.49±0.06*1.21±0.14▲▲201.32±0.05**##1.07±0.10*▲▲400.63±0.01**##△△0.52±0.02**##△△▲▲5-Fu1.19±0.04**##△△▽▽1.01±0.21*▽▽

与0 μg/mL比较, *P<0.05，**P<0.01;

与10 μg/mL比较, ##P<0.01; 与20 μg/mL比较,

△△P<0.01; 与40 μg/mL比较，▽▽P<0.01;

与同一浓度下24 h比较, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01。

2.2　β-咔啉类生物碱对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

正常人胃癌SGC-7901细胞核染色特点为：核染色疏松细致，核仁大而清晰。不同浓度的β-咔啉类生物碱处理后的SGC-7901细胞在荧光显微镜下观察：细胞核固缩，核内染色质在局部区域内凝集，致密浓染，部分可见核碎裂，出现凋亡小体。见图1。由DNA Ladder电泳图可见，随着β-咔啉类生物碱浓度的增加，集中在100 bp处的片段越来越多，细胞凋亡越来越严重，5-Fu也有一定的效果。见图2。

(A. 0 μg/mL; B. 10 μg/mL; C. 20 μg/mL; D. 40 μg/mL; E. 5 μg/mL 5-Fu)

图1不同浓度及5μg/mL5-Fu干预48 h后细胞核染色特点400倍

2.3　PTEN、AKT基因mRNA的表达水平

与阴性对照组比较，不同浓度β-咔啉类生物碱及40 μg/mL浓度5-Fu干预下的PTEN基因mRNA显著上调(P<0.01), AKT基因mRNA显著下调(P<0.01)。不同药物浓度干预组之间PTEN及AKT基因mRNA均有差异，而5-Fu干预组的PTEN基因mRNA高于10 μg/mL浓度β-咔啉类生物碱干预组(P<0.01), 低于20、40 μg/mL浓度β-咔啉类生物碱干预组(P<0.01); 5-Fu干预组的AKT基因mRNA低于10 μg/mL浓度β-咔啉类生物碱干预组(P<0.01), 高于40 μg/mL浓度β-咔啉类生物碱干预组(P<0.01)。见表2。

表2不同药物浓度干预下PTEN、AKT基因mRNA

浓度/(μg/mL)PTENAKT01.01±0.151.00±0.04101.28±0.150.59±0.06**202.75±0.23**##0.38±0.04**##404.64±0.36**##△△0.22±0.02**##△△5-Fu2.12±0.21**##△▲▲0.33±0.01**##▲▲

与0μg/mL比较，**P<0.01; 与10μg/mL比较,

##P<0.01; 与20μg/mL比较, △P<0.05,

△△P<0.01; 与40μg/mL比较, ▲▲P<0.01。

2.4　PTEN、AKT蛋白的表达水平

Western Blotting结果显示，干预48 h后，PTEN蛋白条带亮度随β-咔啉类生物碱浓度增加而增加，而AKT的条带亮度逐渐减弱。见图3。

图2 不同浓度药物干预下SGC-7901细胞的琼脂糖凝胶电泳

图3 WesternBlotting检测PTEN、AKT蛋白的表达

3讨论

胃癌目前仍是亚洲地区第二大致死性疾病[6-7], 在中国发病率居消化道肿瘤第一位，早期胃癌的治疗手段主要以外科手术切除为主。但是手术治疗和(或)其联合放化疗治疗进展期胃癌仍存在巨大的困难[8], 如手术风险、痛苦，放化疗的毒副反应等，患者往往难以耐受。近年来中药在抗肿瘤方面作用机制的研究的越来越受到多方学者的重视。前期研究表明，新疆药材骆驼蓬中提取的去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱混合生物碱具有促进胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用[9]。本实验所使用的β-咔啉类生物碱采用电喷雾质谱仪这一重要手段进行提取[10], 对骆驼蓬生物总碱经行纯化，在药物层面最大限度地排除了干扰因素，也是对“单体复方”这一概念进行有益的探索[11-12]。

细胞的凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞程序性死亡，是从细胞外细胞到细胞内信号通路再到凋亡相关基因和酶的复杂过程[13]。其形态学上有特征性改变：如胞浆浓缩，核染色质固缩，细胞核碎裂，甚至形成凋亡小体。本次实验中通过Hoechest33258细胞核染色法在荧光显微镜下观察细胞核形态学改变，该方法较为直观。在分子层面上，细胞凋亡改变之一就是细胞染色体DNA有控的断裂与降解。DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，由于片段长短成倍数关系，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中呈现特异性梯状ladder图谱，成为细胞凋亡的特异性指标。

PTEN对肿瘤细胞的侵袭和转移具有调控作用，温玉刚等[14]报道，PTEN表达缺失与AKT蛋白表达上调相关。胃癌组织中PTEN基因启动因子过度甲基化可引起该基因的失活，且肿瘤的恶性程度与甲基化呈正相关。AKT参与与细胞增殖或凋亡相关的多条信号通路，如AKT/mTOR信号通路是细胞增殖相关的重要信号通路，AKT可通过激活下游mTOR基因表达促进胃癌细胞生长[15]，而PI3K/AKT途径在抵抗Fas调节凋亡机制中起重要作用，可导致体外细胞的凋亡[16], AKT活性增强与包括胃癌在内的众多恶性肿瘤的发生发展关系密切[17]。

本实验表明，β-咔啉类生物碱对体外培养的SGC-7901细胞的增殖具有一定抑制作用，药物浓度越高抑制作用越明显，并可诱导其凋亡。同时，β-咔啉类生物碱及阳性对照药物5-Fu均可引起PTEN基因mRNA显著上调，AKT基因mRNA显著下调，其中40 μg/mL浓度的调节结果最为显著，显著优于其他浓度及5-Fu, 提示β-咔啉类生物碱可能破坏PTEN/AKT二者之间的平衡，导致PTEN抑癌机制占优势，使细胞向凋亡方向发展，最终实现抗肿瘤的效果。

参考文献

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Exploration on influence and mechanism of

β-carbolines alkaloid on human gastric cancer

SGC-7901 cell proliferation and apoptosis

FAN Yuxiang, ZENG Fanye, ZHANG Hongliang

(DepartmentofOncology,AffiliatedTCMHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumchi,Xinjiang, 830000)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the influence of β-carbolines alkaloid on in-vitro cultured human gastric cancer SGC-7901 cell proliferation and apoptosis and to explore its functional mechanism. MethodsHuman gastric cancer SGC-7901 cells were treated with different-concentration β-carbolines alkaloid for 48 hours so as to detect the cell proliferation and apoptosis, and fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis were conducted to detect the expressions of anti-oncogene PTEN mRNA and protein kinase B (AKT) gene mRNA as well as their proteins in cells. ResultsDifferent-concentration β-carbolines alkaloid could inhibit the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells, in which the efficacy treated with 40 μg/mL was evidently higher than other concentrations and 5-Fu intervention group (P<0.01) and it could also induce cell apoptosis. Different-concentration β-carbolines alkaloid could increase the expressions of PTEN mRNA and its protein and reduce the expressions of AKT mRNA and its protein, in which the efficacy of treatment with 40 μg/mL was evidently higher than other concentrations and 5-Fu intervention group (P<0.01). Conclusionβ-carbolines alkaloid can inhibit the human gastric cancer SGC-7901 cell proliferation and induce cell apoptosis, and the functional mechanism may be achieved by up-regulating PTEN protein and down-regulating AKT protein.

KEYWORDS:β-carbolines alkaloid; human gastric cancer SGC-7901 cell; anti-oncogene PTEN; protein kinase B; cell apoptosis

通信作者:张洪亮, E-mailzhanghongliang@csco.org.cn

基金项目:新疆名医名方与特色方剂学实验室开放基金课题(XJDX0910-2013-6)

收稿日期:2014-12-15

中图分类号:R 735.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)09-041-05

DOI:10.7619/jcmp.201509012