补肾活血方药对糖尿病肾病大鼠肾脏中晚期糖基化终末产物的影响及可能机制※

王悦芬　王树则　赵文景　孟　元　蔡　朕　张胜容

(首都医科大学附属北京中医医院肾病科，北京　100010)



实 验 研 究

补肾活血方药对糖尿病肾病大鼠肾脏中晚期糖基化终末产物的影响及可能机制※

王悦芬王树则1赵文景孟元蔡朕张胜容△

(首都医科大学附属北京中医医院肾病科，北京100010)

【摘要】目的探讨补肾活血方药对糖尿病肾病大鼠肾脏晚期糖基化终末产物(AGEs)的影响及可能机制。方法将48只雄性SD大鼠随机分为4组，即正常对照组、模型组、氨基胍组及补肾活血方组，除正常对照组外，其余3组大鼠予链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病肾病大鼠模型。造模成功后，补肾活血方组大鼠予6.3 g生药/kg补肾活血方水煎剂，氨基胍组大鼠予含盐酸氨基胍的自来水50 mg/(kg·d)，模型组和正常对照组大鼠予等容积自来水灌胃，均每日1次，连续8周。测定各组大鼠空腹血糖(FBG)、肾质量/体质量、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、24 h尿蛋白定量，检测肾小球AGEs(GTE-AGEs)及血清和尿中抗-羧甲基赖氨酸(CML)-AGEs、荧光性-AGEs含量，生物化学法测定肾小球脂质过氧化物(LPO)含量，观察肾脏病理改变。结果与正常对照组相比，模型组大鼠FBG、BUN、Cr、肾质量/体质量、24 h尿蛋白定量、GTE-AGEs、血清荧光性-AGEs及CML-AGEs、肾小球LPO含量均显著升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，补肾活血方组及氨基胍组FBG、BUN、Cr、肾质量/体质量、24 h尿蛋白定量、GTE-AGEs、肾小球LPO显著降低，尿荧光性-AGEs、尿CML-AGEs含量显著升高(P<0.05)。与正常对照组比较，模型组肾小球平均截面积(MGA)、肾小球平均体积(MGV)显著增大(P<0.01)；与模型组比较，补肾活血方组及氨基胍组MGA、MGV显著减小(P<0.05，P<0.01)，2组肾脏病理学改变显著减轻，且2组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论补肾活血方可通过增加尿液AGEs排泄减少AGEs在糖尿病肾病大鼠肾脏的蓄积，降低尿蛋白排泄，减少氧化应激水平，从而发挥其对糖尿病肾病的防治作用。

【关键词】糖尿病肾病；糖基化终产物，高级；补肾；活血；中药疗法；疾病模型，动物；动物，实验；大鼠；

对于糖尿病肾病的治疗，先前的研究焦点主要集中在控制高血糖和高血压。随着医学的发展，葡萄糖依赖性的信号通路是一个重要的研究方向，其中针对高血糖诱导的氧化应激、炎症反应和信号通路异常活化的治疗，可显著改善糖尿病肾病的病理状态，关于分子治疗的热门靶点主要是血管相关的信号通路，包括晚期糖基化终末产物(AGEs)、蛋白激酶C以及腺苷酸活化蛋白激酶[1-2]。中医学认为，糖尿病肾病多为本虚标实之证，本虚多以气阴两虚、肝肾阴虚、阴阳两虚为主，标实多与湿浊、湿热、血瘀有关。本研究通过实验观察补肾活血方对糖尿病肾病大鼠肾脏AGEs的影响，探讨其对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雄性SD大鼠，48只，体质量150～200 g，由北京中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(北京)2007-0001。

1.1.2主要试剂及仪器链脲佐菌素(STZ)、盐酸氨基胍(AG)、胶原蛋白酶Ⅳ、蛋白酶K、标记碱性磷酸酶的抗兔IgG抗体为Sigma公司产品(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO，USA)；羟脯氨酸，购自上海化学试剂公司；脂质过氧化物(LPO)测定试剂盒、血肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)测定试剂盒、24 h尿蛋白定量试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。全自动酶标仪Austria Rainbow 340-700为奥地利Rainbow公司产品；F-4500荧光分光光度计为日本Hitachi产品；观察病理所用显微镜为日本尼康产品，型号为NIKON ECLIPSE 80i；图像分析系统由湖北徕克医疗仪器有限公司提供，型号Mias-2000。补肾活血方由熟地黄、肉苁蓉、怀牛膝、山药、川芎等组成，由石家庄乐仁堂医药集团股份有限公司中药饮片厂提供，经河北医科大学药用植物教研室鉴定为纯品，水煎取汁，药物浓度为1 g生药/mL。

1.2实验方法

1.2.1动物分组将48只雄性SD大鼠随机分为4组，即正常对照组、模型组、补肾活血方组及氨基胍组，每组各12只。

1.2.2模型制备除正常对照组外，其他3组大鼠予STZ 65 mg/kg腹腔注射(溶解于pH 4.5，0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中)建立糖尿病肾病大鼠模型。注射后48 h连续监测，若3次达到下述标准则认为造模成功：FBG≥16.7 mmol/L，尿量大于原尿量的1.5倍，尿糖强阳性；尿微量白蛋白排泄率>30 mg/24 h。正常对照组大鼠予等量柠檬酸缓冲液。

1.2.3给药方法造模成功后，补肾活血方组大鼠予6.3 g生药/kg补肾活血方煎剂，氨基胍组大鼠予含盐酸氨基胍自来水50 mg/(kg·d)(1 g盐酸氨基胍溶解于1 L自来水中)，模型组和正常对照组大鼠予等容积自来水灌胃，均每日1次，连续8周。实验期间所有大鼠均喂养标准饮食，不用胰岛素及其他降糖药物。

1.3观察指标及方法

1.3.1标本采集用代谢笼收集各组大鼠24 h尿标本，计24 h尿量，-20 ℃保存，待查。然后麻醉各组大鼠，腹主动脉取血，分离血清。接着处死各组大鼠，取双肾，去掉包膜称质量，计算肾质量/体质量[双侧肾脏质量之和/体质量(g/g)]。然后分离肾皮质、肾髓质。右肾部分置于10%中性甲醛溶液浸泡固定，待光镜观察病理。其余肾皮质剪碎后-70 ℃冷冻，待检AGEs及LPO。

1.3.2检测指标及方法

1.3.2.1取血清，采用生物化学方法检测BUN、Cr、FBG。取尿采用考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白定量[2]。

1.3.2.2肾小球-AGEs(GTE-AGEs)测定①肾小球提取物(GTE)制作：参照文献[3-4]分离、制备肾小球及肾小球提取物。将肾皮质剪碎、匀浆、离心、沉淀，在沉淀中加氯仿和甲醇(比例为2∶1，V/V)5 mL，去脂，4 ℃摇振过夜，经水化冲洗，用0.5 mol/L醋酸和1 mg/L胃蛋白酶去除非胶原蛋白，再用0.1 g/LⅣ型胶原酶和0.1 g/L蛋白酶K消化处理24 h后，离心取上清液，即为肾小球提取物，用于AGEs含量检测。采用Makita等[4]方法测定肾小球提取物中羟脯氨酸含量。②GTE -AGEs测定：参照Edwards等[5]方法体外孵育形成的核糖核酸酶-AGEs(RNase-AGEs)作为免疫原，免疫大白兔，制备抗AGEs多克隆抗血清，建立竞争性酶联免疫吸附(ELISA)法。抗血清与RNase-AGEs和牛血清白蛋白-AGEs(BSA-AGEs)结合，但不与BSA结合，其滴度为1∶2 000，55 mg/L BSA-AGEs竞争抑制抗血清结合率50%。测定过程：100 mg/L BSA-AGEs[pH 9 .6碳酸缓冲液(PBS)]加于酶标板上，每孔0.1 mL进行包被。洗涤后用0.2 mL 0.2 mol/L PBS(含0.1%BSA，pH 7.4)进行封闭，洗涤后每孔加入50 μL竞争抗原(BSA-AGEs或待测GTE)，然后加入50 μL 1∶1 000抗血清，洗涤后加入标记碱性磷酸酶的抗兔IgG抗体，最后每孔加入0.1 mL 1 g/L对硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)进行显色反应，30 min后测定波长405 nm的吸光度(A值)，计算B/BO，B/BO=(实验A值-无抗血清的背景A值)/(无竞争抗原的总A值-背景A值)。以BSA-AGEs为AGEs标准，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。AGEs含量用AGE·IU表示，1AGE·IU等于0.1 mg BSA-AGEs所含的AGEs量。最终结果用AGE·IU/ mg胶原蛋白表示(简写为IU/mg pr)。批内变异指数为5.2%，批间变异指数为9.6%。

1.3.2.3血清、尿液-AGEs测定①血清、尿液荧光性-AGEs测定：参照蒋建平等[6]方法，取血清、尿液各0.2 mL，0.9%氯化钠注射液稀释至2 mL，用荧光分光光度计测上清液荧光强度(激发波长370 nm，发射波长440 nm，狭缝5 nm。Lowry法测定稀释液中蛋白含量，AGEs含量以每mg蛋白中相对荧光强度(AIU/mg pr)表示。②血清、尿液N-羧甲基赖氨酸(CML)-AGEs测定：取血清、尿液各0.2 mL，0.9%氯化钠注射液稀释至2 mL，以下步骤同GTE -AGEs测定。

1.3.2.4肾小球LPO测定取肾小球提取物，参照试剂盒说明书测定肾小球LPO。

1.3.2.5肾脏病理肾组织经10%甲醛固定后，用常规方法制备光镜切片，行三色套染，应用Mias-2000图像分析仪测定肾小球平均体积及系膜体积。在高倍镜下进行病理分析，每个切片随机选择10个正切的肾小球，测定肾小球平均截面积(MGA)，取其平均值作为每个标本的MGA，计算肾小球平均体积(MGV)。

2结果

2.1大鼠死亡情况治疗结束后，模型组及氨基胍组各有2只大鼠死亡。

2.24组大鼠FBG 、肾质量/体质量及肾功能指标比较见表1。

表1　4组大鼠FBG 、肾质量/体质量及肾功能指标比较　±s

与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

由表1可见，模型组大鼠FBG、BUN、Cr、肾质量/体质量、24 h尿蛋白定量均高于正常对照组(P<0.01)；补肾活血方组及氨基胍组FBG、BUN、Cr、肾质量/体质量及24 h尿蛋白定量均低于模型组(P<0.05)，而补肾活血方组与氨基胍组各项目组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.34组大鼠肾小球、血清及尿中AGEs比较见表2。

表2　 4组大鼠肾小球、血清及尿AGEs比较　±s

与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

由表2可见，模型组大鼠GTE-AGEs及血清荧光性-AGEs、CML-AGEs含量显著高于正常对照组(P<0.05)；与模型组比较，补肾活血方组及氨基胍组GTE-AGEs显著降低(P<0.05)，尿荧光性-AGEs、尿CML-AGEs含量显著升高，并高于正常对照组(P<0.05)；补肾活血方组与氨基胍组各项目组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.44组大鼠肾小球LPO、MGA、MGV比较见表3。

表3　4组大鼠肾小球LPO、MGA、MGV比较

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

由表3可见，模型组大鼠肾小球LPO含量高于正常对照组(P<0.05)，补肾活血方组及氨基胍组显著低于模型组(P<0.05)，补肾活血方组与氨基胍组组间比较无显著差异(P>0.05)。与正常对照组比较，模型组MGA、MGV显著增大(P<0.01)；与模型组比较，补肾活血方组及氨基胍组MGA、MGV显著减小(P<0.05)，补肾活血方组与氨基胍组2组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.54组大鼠肾脏病理观察结果电子光镜下，正常对照组大鼠肾小球体积正常，肾小球PAS红染区无扩大，系膜区无增宽，毛细血管管腔开放良好(见封3，图1)；模型组大鼠肾小球体积显著增大，肾小球PAS红染区扩大，系膜区增宽，毛细血管管腔受压(见封3，图2)；补肾活血方组肾小球体积较模型组显著减小，肾小球系膜区噬复红蛋白含量减少，毛细血管管腔受压改善(见封3，图3)；氨基胍组肾小球体积较模型组减小，肾小球系膜区PAS红染区缩小，系膜区无明显增宽，毛细血管管腔受压改善(见封3，图4)。

3讨论

AGEs的形成主要与体内葡萄糖水平、氧化应激有关，形成后AGEs主要被局部巨噬细胞通过清道夫受体内吞并，并降解成可溶性多肽(LMN-AGEs)进入血液循环，经肾脏过滤，随尿液排出。AGEs是一组化合物，目前明确结构的有羧甲基赖氨酸(CML)、吡咯素、戊糖苷素等，其常用的检测方法有：①抗CML结构的免疫学检测方法；②针对其荧光特性的荧光分光光度计法。有研究报道，荧光性-AGEs最容易在肾组织沉积，是重要的肾毒性物质[7]。如肾功能受损，不能及时清除血液中未能排除的降解产物，可再次与蛋白结合形成AGEs[8]。在糖尿病患者和动物的血管壁及肾脏中，AGEs含量明显增加，在肾脏AGEs与晚期糖基化终产物受体(RAGE)结合后可通过氧化应激诱导血小板衍化生长因子及转化生长因子的表达，促进细胞外基质的产生，增加血管通透性，使血液处于高凝状态等机制参与肾脏纤维化的进展。

中医学认为，肾主水，主封藏，藏先天之精和后天之精，肾络瘀阻可导致水液运行及肾封藏功能异常，精津外泄，从而出现水肿及蛋白尿。我们结合AGEs在糖尿病肾病、透析相关心脑血管并发症发病过程中的机制，提出糖尿病肾病肾络瘀阻发病学说，并以补肾活血法治疗，在临床中取得了良好疗效。前期研究显示：①一定浓度的补肾中药怀牛膝、淫羊藿、熟地黄对体外蛋白非酶糖化产物有直接抑制作用[8]；②补肾活血方通过增加肾脏对AGE-肽排泄，降低端脑AGEs的积累及端脑、海马组织β-淀粉样肽(AβP)含量，改善由雌激素缺乏、肾虚所致的学习记忆下降及心脑血管并发症[9]。为进一步探讨补肾活血化瘀药物对肾脏的保护作用及机制，本研究通过动态分析肾组织、循环、尿液中AGEs三者的关系，观察肾清除毒素的作用与肾的气化、封藏功能的关系。

本研究显示，模型组大鼠肾小球体积明显增大，24 h尿蛋白定量增加，肾功能受损，肾小球及血清中AGEs和肾小球LPO含量均明显增加，尿液中AGEs含量与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)；氨基胍组及补肾活血方组在大鼠FBG下降情况下，肾小球体积、24 h尿蛋白定量及肾功能受损程度均有明显改善，且大鼠肾小球中AGEs和LPO含量均明显减少，尿液对AGEs排泄量显著增加，但血清中CML-AGEs较模型组和正常对照组有增加趋势。提示模型组大鼠由于血糖增加，导致机体氧化应激增强，体内AGEs的生成增加，血中AGEs含量增加，但尿液对其排泄无明显改变，从而加速组织中AGEs沉积。

补肾活血方由怀牛膝、生地黄、牡丹皮等组成，其对糖尿病肾病大鼠的防治作用与氨基胍治疗作用类似，体现在减少AGEs在肾小球的沉积，降低肾小球LPO水平，减少组织的氧化应激水平，保护肾小球结构和功能。氨基胍为AGEs抑制剂，它能特异性抑制AGEs的形成，但对已经交联的AGEs无裂解作用。本研究提示，氨基胍减少AGEs在肾小球沉积的机制可能为：①阻断从蛋白质非酶糖化反应中间产物Amadori产生到AGEs的转化，抑制AGEs形成；②抑制可溶性多肽与蛋白再次交联；③促进可溶性多肽经尿液排泄；④减少肾小球LPO水平，降低肾脏氧化应激水平。补肾活血方减少AGEs在肾小球沉积的机制可能为：①怀牛膝、熟地黄能直接抑制AGEs形成[9]；②促进可溶性多肽经尿液排泄；③减少肾小球LPO水平，降低肾脏氧化应激水平。

关于血液、尿液及肾脏中AGEs的关系，郑凝等[10]认为肾脏组织中AGEs含量与血清中荧光性-AGEs有较好的相关性，提出血清中AGEs能反映肾脏及全身组织中AGEs的含量，本实验与上述结果有不同之处。本实验选用2种检测方法测定了血清和尿液中不同成分AGEs的含量，提示血液循环中物质的增多不等同于组织中该物质沉积增加，应动态看待血清、尿液、组织中物质循环和转移，在机体中增加有毒物质清除也是保护内环境稳定的重要因素。AGEs从组织到循环到尿液的转移能体现中医肾的气化功能，可作为保护肾封藏功能的重要标志物。

参考文献

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[8]王健，李恩，王悦芬.补肾中药对体外蛋白非酶糖化产物的抑制作用[J].河北中医，2009，31(7)：1068 -1070.

[9]王悦芬，王彦刚，李恩，等.补肾方药对去卵巢大鼠端脑、海马晚期糖化终末产物及β-淀粉样肽含量的影响[J].中国中西医结合杂志，2004，24(3)：247 -250.

[10]郑凝，张宏，曾淑范.糖尿病肾病患者血清低分子糖化终末产物的测定[J].中国慢性病预防与控制，2005，13(6)：289-291.

(本文编辑：曹志娟)

※项目来源：“重大新药创制”科技重大专项课题(编号：2009zx09502-014)；国家自然科学基金面上项目(编号：81072713)；首都医学发展科研基金项目(编号：SF-2009-I-06)

1中央财经大学2012级电子商务，北京100081

Effects and possible Mechanism of Bushen-huoxue formulas on AGEs in kidney of diabetic ratsWANGYuefen*,WANGShuze,ZHAOWenjing,etal.*DepartmentofNephrology,BeijingChinesemedicinehospitalaffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100010

【Abstract】Objective Explore the effects and possible mechanism of Bushen-huoxue formulas on advanced glycosylation end products (AGEs) in kidneys in diabetic rats. Methods 48 male SD rats were randomly divided into four groups: normal control group (group N), model group (group DM), positive control medicine group with aminoguanidine (group AG), and treatment group with Bushen-huoxue formulas (group BSHX). Diabetes models were induced by injection of streptozocin. After the treatment of aminoguanidine, Bushen-huoxue for 8 weeks, kidney weight/body weight, blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Cr), total 24 h urine protein were measured for each group; glomerular AGEs (GTE-AGEs), serum and urine of CML-AGEs、fluorescent-AGEs were detected with enzyme-linked immunoassay and fluorescence; The content of glomerular lipid peroxide (LPO) was detected with biochemical method. The pathological changes of kidney were observed. ResultThe level of FBG, BUN, Cr, kidney weight/body weight, 24 h urine protein, GTE-AGEs, serum fluorescence-AGEs, the serum levels of CML-AGEs and GTE-LPO were all significantly higher in group DM than those in group N (P<0.05,P<0.01). The FBG, BUN, Cr, kidney weight/bodyweight, 24h urine protein, GTE-AGEs and GTE-LPO were significantly lower in group BSHX and group AG than those in group DM; the content of urine fluorescence-AGEs, urine CML-AGEs were significantly higher. MGA and MGV in group DM were all significantly increased as compared with those in group N (P<0.01). MGA and MGV in group BSHX and group AG were all significantly increased as compared with those in group DM (P<0.05,P<0.01). The pathological changes of kidney were reduced in the rats of group BSHX and group AG, there was no significant difference between group BSHX and group AG on renal pathology change (P>0.05). Conclusion Bushen-huoxue formulas can reduce accumulation of AGEs in the kidney of diabetic rats, reduce the excretion of urinary protein, and reduce oxidative stress levels by increasing the excretion of urine AGEs. Thus, it plays roles in prevention and treatment of diabetic nephropathy.

【Key words】Diabetic nephropathy; Glycosylation end products: Advanced; Tonifying kidney; Activating blood; Traditional Chinese medicine therapy; Disease models, animal; Animal experiment; Rat

(收稿日期：2014-12-31)

作者简介：王悦芬 (1967—)，女，主任医师，教授，硕士研究生导师，博士。从事中医内科肾脏病及其并发症临床、教学及科研工作。

通讯作者：△首都医科大学附属北京中医医院肾病科，北京100010

【中图分类号】R587.24；R285.5

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2015)12-1827-05

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2015.12.021