基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7方法的建立



技术与方法

基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7方法的建立

赵娟娟1,2，徐华林1,2，陶弋婧1,2，郭萌萌1,2，周涯3，陈超1,2，秦娜琳1,2，郑静1,2，田丹1,2，徐林1,2

(1. 遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地，贵州 遵义563099；2.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义563099；3. 遵义医学院 医学物理学教研室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 本研究旨在利用常规荧光燃料SYBR GreenⅠ，通过茎-环法设计原理，建立有效检测微小RNA-7(miR-7)的Real-time PCR方法。方法 利用miRBase数据库获得miR-7的成熟体序列，分别设计1条miR-7特异性反转录引物，以及Real-time PCR上游和下游引物；观察不同退火温度和不同引物浓度对扩增miR-7的Ct值影响，选择最优的退火温度和引物浓度；测定不同稀释度RNA下Real-time PCR扩增 miR-7的效果；并利用该方法检测小鼠4个器官中miR-7的灵敏性和特异性。结果 在基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR检测法中，miR-7扩增的最优退火温度为60 ℃，最优引物浓度为10 μmol/L；在不同稀释度RNA下miR-7的Ct值线性关系较好，且在模板RNA低于100 pg的条件下，该方法仍可有效检测miR-7分子；最后有效检测出小鼠4个不同器官中miR-7的差异性表达。结论 成功建立基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7的方法，可为后续研究miR-7的生物学功能提供了重要工作基础。

[关键词]茎-环Real-time PCR法；SYBR GreenⅠ；微小RNA-7；表达

微小RNAs(miRNA)是一类内源性长18~25个核苷酸的单链非编码RNA分子，主要通过结合靶基因的3’非翻译区抑制靶基因的翻译或诱导靶基因降解，从而调控真核基因的表达。大量研究显示特定miRNAs分子参与多种临床疾病的发生过程，特定miRNAs表达水平的变化与包括肿瘤、自身免疫性疾病等临床疾病的预后密切相关，因此，其表达水平的检测也逐渐发展为相关临床疾病诊断的重要辅助手段。

微小RNA-7(miR-7)作为miRNA家族成员之一，已有研究显示其不仅在多个机体组织、器官及细胞中存在表达[1-2]，且在组织器官的发育、分化及病理损伤过程中发挥重要作用[3-5]。我们课题组新近研究结果也显示miR-7不仅在肺脏、脾脏等器官中高表达，且该基因敲减后小鼠的心、肝及肺等多个重要器官发生明显的病理学损伤[6-7]。此外，miR-7在包括肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中存在较低表达，并可通过对包括PIK3R3、CGGBP1和EGFR等靶基因的调控来调节肿瘤细胞的生长和侵袭转移[8-11]，提示其是重要的肿瘤潜在生物治疗靶标。因此，对特定组织或细胞中miR-7表达水平的检查不仅对于阐明其生物学功能，且对于相关临床疾病发生机制的认识，以及临床诊治均具有积极意义。因此，本研究中，我们拟在前期工作基础上，利用茎-环法引物设计的原理，建立基于荧光染料SYBR GreenⅠ的Real-time PCR检测miR-7方法，并初步观察其检测不同器官中miR-7表达的灵敏性和特异性，以期为后续相关工作提供重要的实验技术平台。

1材料与方法

1.1材料FVB背景的雌性小鼠(南京大学模式动物研究所)，总RNA抽提试剂Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(RR037A)和SYBR Premix Ex Taq II (2×)(RR820A)均为TAKARA公司产品，miR-7和U6均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其中U6为商品化引物(扩增长度为106 bp)，作为检测miR-7表达的内参，miR-7探针(000386)和U6探针(001973)引物购买于Life Technologies公司。

1.2方法

1.2.1MiR-7成熟序列的获得在miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)中获得miR-7成熟序列(MI0000728)：5' -UGGAAGACUAGUGA UUUUGUUGU-3'。

1.2.2茎-环法miR-7引物序列的设计对于miR-7，我们设计了1对半引物：1条特异性反向引物用于反转录，另外1对用于miR-7的实时定量PCR扩增的正向引物和反向引物。特异性反转录引物带有1段固定的序列，可以形成1个茎环，其5' 端的44个核苷酸序列是固定的，固定的序列为：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3'(划线部分为互补的核苷酸环)，其形成一个14核苷酸环和16核苷酸茎的结构，其3' 端的6个核苷酸与miR-7反向互补(见表1)。

表1反转录引物及实时荧光定量PCR 的引物

基因目录碱基序列扩增长度(bp)MiR-7miRNA的成熟体序列UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU反转录引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAACAReal-timePCR上游CGGCGGTGGAAGACTAGTGATTReal-timePCR下游ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG63

正向引物长25~32个核苷酸，除了miR-7成熟序列3' 端6个碱基的剩余部分作为上游引物5'-TGGAAGACTAGTGATT-3'(见表1)，为了保证Tm接近65 ℃，在5' 端添加了悬垂碱基CGGCGG；通用的反向引物中15个左右核苷酸对应特异反转录引物的茎环结构部分，为了与正向引物的Tm趋于一致，可以根据反转录引物序列调整，或者在5'端加上悬垂碱基。MiR-7的整个茎-环设计原理流程见图1。

图中红色区域为引入44个核苷酸固定序列，横线标注位置为Real time PCR上下游结合区域，小圆点为SYBR GreenⅠ染料与DNA结合区域。图1　基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR 检测法示意图

1.2.3总RNA提取及质量检测取小鼠的心、肝、脑、肺4个器官，根据TAKARA公司的使用说明，采用Trizol法提取细胞总RNA，所得RNA溶于0.1%DEPC水中。总RNA样品经过1%琼脂糖电泳检测RNA完整性，再用分光光度计测定RNA的浓度，读取在260 nm和280 nm波长处光吸收值的比值。

1.2.4RNA特异性反转录在进行反转录时用的引物不再是Oligo dT和Random primer，而是改用miRNA对应的特异性茎-环反向引物。取小鼠心、肝、脑、肺4个组织器官RNA，参照PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂说明操作合成cDNA。miR-7特异性反转录体系为(总体系10 μL)：5×PrimerScript Buffer 2 μL，Primer Script Enzyme Mix 0.5 μL，miR-7特异性反转录引物(10 μmol/L)1 μL或U6特异性反转录引物(10 μmol/L)1 μL，RNA 1 μg，加水(无RNA酶)补至10 μL体系；同时用RNase-free水10倍梯度稀释RNA，使10 μL反转录体系分别含有RNA 1 000 ng、100 ng、10 ng、1 ng、100 pg(RNase-free水溶解)，即以miR-7为引物特异性反转录5个体系，使其各体系中分别反转录RNA 1 000 ng、100 ng、10 ng、1 ng、100 pg。U6同上进行反转录。反应条件均为：42 ℃温育15 min，85 ℃ 5 s灭活逆转录酶，4 ℃保存。

1.2.5退火温度及茎-环引物浓度对茎-环Real-time PCR法检测表达水平的影响以U6为内参，miR-7及U6的Real-time PCR反应体系均为25 μL：SYBR Premix Ex Taq II (2×) 12.5 μL，模板cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，补充双蒸水至25 μL。Real-time PCR检测时，上游引物为特异性引物序列，下游为通用引物(各有5个温度梯度)。反应条件为：95 ℃变性30 s，95 ℃ 5 s，6 ℃ 30 s，45个循环，循环结束后从65 ℃开始每10 s上升0.5 ℃，取荧光值绘制溶解曲线，并在2.5%的琼脂糖凝胶下观察，确定扩增产物的特异性。

1.2.6RNA浓度对茎-环引物的影响将1.2.4中获得的不同浓度的RNA反转录产物cDNA，在最优反应条件下进行Real-time PCR，扩增产物在2.5%的琼脂糖凝胶下观察，并取Ct值绘制标准曲线，确定扩增产物的特异性及线性关系。

1.2.7茎-环法Real-time PCR检测小鼠4个组织器官miR-7的表达水平采用Trizol法提取小鼠心、肝、脑、肺4个组织器官RNA。反转录方法同上，并采用上述最优条件，进行Real-time PCR检测小鼠4个组织中miR-7的表达水平，用2-ΔΔCt法分析数据结果。

1.2.8对比TaqMan探针法，观察茎-环Real-time PCR法检测miR-7的特异性和灵敏性采用Trizol法提取小鼠心、肝、脑、肺4个组织器官RNA。按照Life Technologies公司标准操作说明书，进行反转录及Real-time PCR检测小鼠4个组织中miR-7的表达水平，用2-ΔΔCt法分析数据结果。

2结果

2.1RNA质量的检测提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计测定OD260/OD280的比值，将没有降解、OD260/OD280的比值为1.8~2.1之间的RNA样品进行反转录。反转录条件为： 42 ℃温育15 min，85 ℃ 5 s灭活逆转录酶。逆转录产物置于4 ℃保存。

2.2退火温度及茎-环引物浓度对miR-7扩增的影响我们首先在不同浓度的茎-环引物(5 μmol/L和10 μmol/L)在不同的退火温度(57.3、60.0、62.2 ℃)下分别进行miR-7的扩增。如图2所示，目的基因miR-7得到了有效的特异性扩增，条带为63 bp。此外，退火温度为60.0 ℃，且引物浓度为10 μmol/L时，特异性及产物丰度是最佳的(见图2B，P<0.05)。

A：不同退火温度和不同引物浓度下miR-7的扩增曲线；B：溶解曲线；C：琼脂糖凝胶电泳图。1~6分别为不同的退火温度和不同引物浓度，其中1为10 μmol/L，60.0 ℃；2为5 μmol/L，60.0 ℃；3为5 μmol/L，57.2 ℃；4为5 μmol/L，60.0 ℃；5为5 μmol/L，57.2 ℃；6为5 μmol/L，62.2 ℃；M为Maker。图2　退火温度及茎-环引物浓度对miR-7 Ct值的影响

2.3RNA浓度对miR-7扩增的影响本研究进一步利用上述最优扩增条件(扩增引物10 μmol/L、退火温度60 ℃)，观察不同的RNA浓度条件下，逆转录后对miR-7扩增的可能影响。结果显示，随着RNA浓度的降低，miR-7的Ct值也逐渐增大(见图3A)，琼脂糖凝胶电泳图呈现清晰目的条带(见图3B)，且其线性相关系数达到0.993 3(见图3C，P<0.05)。

A：不同稀释度的RNA下miR-7的扩增曲线；B：琼脂糖凝胶电泳图； C：RNA浓度与荧光信号阈值的线性关系图。1~5分别代表了1000 ng、100 ng、10 ng、1 ng和100 pg等5个稀释度RNA下的琼脂糖凝胶电泳图；M为Maker。图3　RNA浓度对miR-7产物的影响

2.4茎-环法检测小鼠4个组织器官中miR-7的表达水平如图3A显示miR-7和内参基因U6的扩增曲线平滑且Ct值均处于15~30之间，说明对于检测组织中miR-7的水平有较高灵敏性；图3B显示溶解曲线平滑且为独立单峰，且图3C、D显示的目的条带结果均提示茎-环法扩增miR-7的特异性好。

A：茎-环法检测小鼠4个组织器官中miR-7表达的扩增曲线；B：4个组织器官中miR-7表达溶解曲线；C：进行Real time PCR扩增后的miR-7产物的琼脂糖凝胶电泳图；D：进行Real time PCR扩增后的U6产物的琼脂糖凝胶电泳图。1~4分别为肺、脑、心、肝4个组织器官；M为Maker。图4　茎-环法检测小鼠4个组织器官中miR-7的表达水平

2.5参照TaqMan探针法，鉴定茎-环法的准确性为了进一步观察茎-环法检测不同组织中miR-7表达水平的准确性，本实验对小鼠4个不同组织器官心、脑、肝、肺等分别利用TaqMan探针法和茎-环法进行扩增。如图5A所示：TaqMan探针法可有效扩增不同组织器官中miR-7，且在脑组织中miR-7表达水平相对最高(相对水平为5.07±1.1)，而心脏组织中miR-7表达水平相对最低(检测的小鼠4个器官中其相对表达水平最低，因此将其作为参照，相对水平为0.99±0.15)，这与我们前期结果一致[1]，另外在本次实验中也测定的肺脏和肝脏中miR-7的相对表达水平分别为1.67±0.61、1.38±0.45。茎-环法检测结果显示在脑组织中miR-7表达水平也最高(见图5B，相对水平为58.52±5.1)，而心脏组织中miR-7表达水平最低(见图5B，分析方法同上，作为4个器官相对表达水平的参照，相对水平为0.97±0.35)，同时肺脏与肝脏中miR-7的相对表达水平分别为3.01±0.78、1.65±0.56，与TaqMan探针法的检测结果高度一致。

A：通过TaqMan探针法检测肺、脑、心、肝4个器官中miR-7相对水平的结果；B：通过茎-环法检测肺、脑、心、肝4个器官中miR-7相对水平的结果。　　图5　茎-环法与探针法检测器官中miR-7的表达水平的比较

3讨论

目前，定量检测miRNAs常规使用的技术有：Northern blotting杂交法、微阵列法、克隆和测序法、Real-time PCR法等。其中Real-time PCR法是较为方便快捷、灵敏，应用十分广泛，如商品化的miRNA专用定量试剂盒(TaqMan探针法)是研究者大多采用的miRNA 定量方法。由于miRNA的成熟体序列较短，与常规PCR反应中的引物长度相近，没有poly(A)，家族成员序列差异小，在物种或组织之间的表达水平普遍较低等，因此常规利用Oligo dT的mRNA逆转录过程难以有效将miRNAs的成熟体逆转录，并进行后续Real-time PCR扩增过程。近年来发展起来的茎-环引物反转录检测法则有效解决了该问题，其基本原理是通过人为延长逆转录后的miRNA成熟体长度以利于后续的Real-time PCR扩增，该方法突出优点是特异性强、灵敏度高、样品消耗量少，还能区分同一miRNA家族的不同变体。在此原理的基础上还形成了商品化的miRNAs定量探针试剂盒(Taqman探针)等用于特定miRNAs分子表达水平的检测[12]。然而，由于Taqman探针等序列的设计与合成通常需借助商业公司，价格比较昂贵，特别在长期进行相关miRNAs表达水平检测中购买等十分不便。因此，利用茎-环引物法的基本原理，建立其他相关检测方法对于长期研究特定miRNA表达及功能来说仍具有积极意义。

SYBR GreenⅠ是常规Real-time PCR染料，其相关实验操作流程简单、设备和试剂要求相对较低、经济实惠，便于一般实验室开展。本研究中，我们尝试利用茎-环引物法的基本原理，结合基于荧光染料SYBR GreenⅠ的Real-time PCR法实验过程，探讨建立利用荧光染料SYBR GreenⅠ的Real-time PCR检测miR-7表达水平的方法。研究结果显示，不同的扩增引物浓度(5 μmol/L和10 μmol/L)对miR-7成熟体的扩增影响显著；然而，扩增条件中，60 ℃条件下，miR-7的扩增产物量最大，提示该扩增温度对miR-7成熟体的扩增具有重要影响。此外，本实验还发现，在低于100 pg 浓度的模板RNA情况下，基于SYBR GreenⅠ的Real-time PCR法仍可以有效扩增miR-7片段，显示出该方法具有较好的灵敏度。类似地，Wu等[13]研究显示，浓度为20 pg RNA进行反转录时也可检测到目的miRNA的存在。为了进一步观察该方法的灵敏度，我们利用该方法检测了包括心、肝等4个小鼠组织器官中的miR-7表达水平。结果显示，本方法可以有效检测出这4个不同组织器官中的miR-7表达水平。更为重要的是，本方法的检测结果与当前标准商品化的miR-7的Real-time PCR探针试剂盒检测结果保持高度一致，小鼠4个组织器官miR-7的Ct值，均处于20~30之间，提示本方法具有高度特异性。类似地，赵丽等[14]也利用茎-环引物反转录检测法建立了检测miR-421的技术方法，体现了基于茎-环引物反转录原理的特定miRNA分子检测方法的潜在推广应用价值。此外，本方法设计的Real-time PCR扩增引物能用SYBR GreenⅠ预混液所推荐的反应条件：即95 ℃变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃30 s来对miR-7成熟体进行扩增，提示其可与其他基因同时进行Real-time PCR扩增，因此，简单方便易于开展。综上实验结果表明，茎-环法和常用染料结合可较好地检测miR-7的相对表达水平，为今后miR-7的定量检测奠定了基础，也可为其它miRNA此类方法的检测提供基础数据。

总之，本研究中我们成功建立了基于SYBR Green Ⅰ 的Real-time PCR定量检测miR-7方法，可为后续进一步开展miR-7在特定组织和细胞中表达水平检测和功能研究提供了重要的工作基础。

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[收稿2015-10-06;修回2015-11-06]

(编辑：王福军)

Stem-loop real-time PCR assay for quantitative detection of miRNA-7 by specific primers using SYBR Green I

ZhaoJuanjuan1,2,XuHualin1,2,TaoYijing1,2,GuoMengmeng1,2,ZhouYa3,ChenChao1,2,QinNalin1,2,ZhengJing1,2,TianDan1,2,XuLin1,2

(1.Department of Immunology, Zunyi Medical University, Talent Base of Biological Therapy of Guizhou Province, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Department of Medical Physics, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To establish an effective method of Real-time PCR quantitative detection of microRNA-7 (miR-7), based on the principles of stem-loop theory using conventional fluorochrome SYBR GreenⅠ.Methods Mature sequences of miR-7 were obtained from miRBase database, and then 3 primers were designed, including a specific reverse transcription primer, as well as one forward and one reverse primer for Real-time PCR. Next, different annealing temperatures and distinct concentrations of primer were performed for the analysis of optimal Ct values of miR-7 in Real-time PCR assay. Furthermore, different concentrations of RNA were used for the detection of miR-7 expression level in the condition of optimal annealing temperature and primer concentration. Finally, the distinct expression level of miR-7 in murine four different organs was analyzed.Results In stem-loop Real-time PCR assay, the optimal annealing temperature and primer concentration for the amplification of miR-7 were 60 ℃ and 10 μmol/l, respectively. Moreover, Ct values of miR-7 showed good linear relationship detection, and the level of miR-7 could be also detected in samples with 100 pg RNAs. Finally, the distinct level of miR-7 expression in murine four different organs could be determined by stem-loop Real-time PCR assay.Conclusion The stem-loop Real-time PCR using SYBR GreenⅠcould be well used for the quantitative analysis of miR-7, which provided the bases for the successive research work on the biological function of miR-7.

[Key words]Stem-Loop Real-Time PCR; SYBR GreenⅠ; microRNA-7; expression

[中图法分类号]R392-33

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0636-06

[通信作者]徐林，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤免疫学和分子免疫学，E-mail:xulinzhouya@163.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：31370918)；教育部“新世纪优秀人才计划”资助项目(NO：NCET-12-0661)；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目(NO：黔教合KY字[2014]212)。