羧甲基壳聚糖对钛颗粒致心脏毒性的保护作用



基础医学研究

羧甲基壳聚糖对钛颗粒致心脏毒性的保护作用

颜姝1,张重威1,龙文昕1,张楠1,罗艳桃1,董俊2

(1.长沙医学院 临床学院2012级临床医学专业,湖南 长沙410219；2.长沙医学院 基础医学院生理学教研室, 湖南 长沙410219)

[摘要]目的 探讨羧甲基壳聚糖对钛颗粒致心脏毒性的保护作用。方法 将30只家兔随机分为3组，分别开胸后心肌内注射等量的生理盐水、钛颗粒和生理盐水、钛颗粒和羧甲基壳聚糖，术后1周，利用分光光度计和紫外分光光度计分别检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性来观察心功能的变化、取心肌组织行HE染色观察心脏组织病理改变。结果 钛颗粒使血清中LDH及CK-MB活性明显升高(P<0.01)，而羧甲基壳聚糖能够明显降低LDH、CK-MB的活性。心肌HE染色结果显示，钛颗粒会使心肌细胞水样变性，胞质淡染，细胞核染色不均、细胞空泡、心肌细胞排列紊乱，而羧甲基壳聚糖能够明显减轻钛颗粒导致的心肌毒性反应。结论 羧甲基壳聚糖对钛颗粒致心脏的毒性作用起到一定的保护作用。

[关键词]羧甲基壳聚糖；钛颗粒；心脏毒性

现已发展成熟的心血管支架用材主要有不锈钢、钴铬合金及镍钛合金,但各有不足，而不含毒性元素、具有良好生物相容性及高强度低弹性模量的钛合金已成为生物医用材料领域的研究热点。基于优异的塑性成形性能和生物力学相容性，钛合金有望成为一种新的心血管支架材料。 目前钛广泛用于骨科、牙科，并表明钛比其他金属更具优势[1-2]。在钛广泛应用的同时，其毒理学作用也越来越受到人们的关注。早在1992年，潘姜萍等[3]发现高稀释度的钛对肝肾培养细胞均有毒性作用。中毒后的细胞出现水肿、边界模糊和消失;细胞核水肿、不规则,胞浆颗粒增多呈衰老现象,提示钛进入人体引起的肝肾慢性蓄积毒作用不容忽视。 但是其机制并未完全研究清楚。羧甲基壳聚糖是一种具有良好生物相容性，无毒副作用的天然物质，有抗凝血、抗炎、协同抗肿瘤[4]，螯合重金属离子等功能[5]。其表面结构类似于球状海绵，有大量的孔隙，可以承载并达到缓释药物的作用，延长药物治疗的时间[6]，因而作为一种载体被广泛应用。本研究将观察羧甲基壳聚糖是否能对钛颗粒导致的心肌毒性作用起到保护作用，从而为钛毒性的预防措施提供一定的理论依据。

1材料

钛粉(清河县佳润金属材料有限公司)；羧甲基壳聚糖(德州海利安生物科技股份有限公司)；BD胰岛素注射器(Becton dickinson and Company)；乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肌酸激酶同工酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；紫外分光光度计(UV757CRT)；可见分光光度计(722)；恒温水浴锅(DU-20G)；显微镜(CX21-BIM)；高速离心机(TGL-10B)。

2方法

2.1钛悬液的制备将15 mg的钛粉用95%的医用酒精于1.5 mL EP管浸泡消毒，去其表面内毒素，离心4 min(10 000转/min)，抽去上层酒精，用无菌PBS缓冲液反复清洗残留酒精后抽取1 mL无菌PBS缓冲液于EP管中，制成约为15 mg/mL的钛悬液。

2.22%羧甲基壳聚糖凝胶的制备称取羧甲基壳聚糖粉末0.2 g溶于10 g三级超纯水中于恒温水浴锅中加热充分混匀，制成浓度为2%的羧甲基壳聚糖凝胶，高温高压灭菌备用。

2.3实验分组取健康家兔30只，随机分为3组，每组10只，分别为空白对照组、钛中毒组、羧甲基壳聚糖组。25%乌拉坦(4 mL/kg)经耳缘静脉将兔子麻醉后，仰卧固定于手术台，备皮，铺无菌孔巾，沿胸骨体左缘切开皮肤，钝性分离第3、4肋肋间肌，暴露纵隔及心脏，剪开心包，于左室前壁心肌选取8点，空白对照组用胰岛素注射器缓慢注射生理盐水，每点注射0.1 mL。钛中毒组注射钛悬液和生理盐水，每点注射0.1 mL。羧甲基壳聚糖组注射钛悬液及2%羧甲基壳聚糖，每点注射0.1 mL。消毒缝合关闭胸腔。术后肌肉注射80万个单位的青霉素防感染。

2.4LDH、CK-MB检测家兔心功能术后1周心脏取血分离血清，严格按照测试盒说明书，用分光光度计在波长为460 nm处检测乳酸脱氢酶(LDH)活力，紫外分光光度计在波长为340 nm处检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)活力。

2.5HE染色观察家兔的心肌结构变化取血完毕后，剖开胸腔，取心脏用生理盐水冲洗，10%甲醛溶液固定、修样、脱水，石蜡包理切成5 μm厚的心脏组织切片，HE染色后光镜下观察。

3结果

3.1血清心肌LDH、CK-MB活力的检测结果给药1周后结果表示，钛中毒组与空白对照组相比较，心肌酶LDH、CK-MB均明显上升(P<0.01)。羧甲基壳聚糖组LDH、CK-MB较钛中毒组均明显下降(P<0.01，见表1)。

组别LDH(U/L)CK-MB(U/L)A2275.36±131.701265.88±234.03B5075.10±288.88*2304.96±165.60*C3763.20±249.58*#1621.85±95.63*#

A：空白对照组；B：钛中毒组；C：羧甲基壳聚糖组。*：P<0.01, B组与A组比较；#：P<0.01, C组与B组比较。

3.2心肌HE染色结果术后1周取家兔心脏行HE染色，均在400倍下观察，空白对照组心肌组织基本正常(见图1A)，钛中毒组的心肌细胞出现了明显的细胞水肿，胞质淡染，细胞核染色不均、细胞空泡、心肌细胞排列紊乱(见图1B)，羧甲基壳聚糖组心肌细胞水肿明显减轻，细胞形态、心肌排列基本正常(见图1C)。

A：空白对照组；B：钛中毒组； C：羧甲基壳聚糖组。图1　各组心肌HE染色结果的比较(HE×400)

4讨论

对于各种原因造成血管重度狭窄的患者，植入血管支架是目前主要治疗手段。钛虽然被认可为最安全的材料之一，其抗腐蚀性能在逐步提高，但在机体复杂的内环境下，其表面仍会被腐蚀，不断释放出钛颗粒，导致组织细胞的变性、坏死、非特异性炎症、过敏反应，甚至肿瘤的形成。国内外均有案例报告在基本无磨损交互运动的耳部和腹部，钛周围散布着钛颗粒，并出现了周围组织的炎症和异物肉芽肿[7-8]，提示我们血管支架植入后所致的再狭窄、心室颤动等并发症可能也与钛颗粒损伤有关。

壳聚糖具有抗炎、抑菌、抗胃溃疡、抗心律失常等作用，目前在临床上广泛用作止血敷料、抗菌敷料，药物基因载体等。本实验发现羧甲基壳聚糖可以明显减轻心肌组织受损程度，表明其对心脏具有一定的保护作用，并且能显著降低血清中心肌酶 LDH、CK-MB的水平，表明其能有效防止钛颗粒对家兔心肌细胞的损伤和破坏。研究表明壳聚糖对氧自由基具有一定清除效果，随着浓度递增抗氧化损伤越显著[9]，一定程度上能够减轻钛颗粒诱导巨噬细胞释放H202导致的氧化损伤。在骨组织的研究中，钛颗粒能够通过激活NF-κB信号通路，上调MIF、TNFα、COX-2等炎症因子的表达，促进植入体周围炎症反应[10]，还可以通过p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号传导通路引发炎症反应[11]。而羧甲基壳聚糖具有抑制p38MAPK和NF-κB信号传导通路[12-14]的双重效应，通过抑制一氧化氮的产生减轻炎症反应。也有研究表明壳聚糖可以抑制TNFα、cox-2等炎症介质的产生，但是羧甲基壳聚糖是否具有共性并不清楚。Shu等[15]的研究表明壳聚糖能够激活Akt和与细胞存活/增殖相关的ERK1/2信号通路，提高缺氧条件下血管内皮细胞生存率，可能也与此有关。魏雅楠[16]在钴铬合金上做了羟丁基壳聚糖的涂层，其在体液模拟的条件下表现出良好的血液相容性和细胞相容性，有望作为新型的涂层支架。

虽然本实验观察到心肌酶结果显示出羧甲基壳聚糖干预后较钛染毒后LDH,CK-MB活性明显降低但仍然比对照组高，且差异具有统计学意义，可能原因有以下几点：①血清中的药物的效果往往与剂量成正比，可能是羧甲基壳聚糖浓度太低的原因；②实验时间太短，而羧甲基壳聚糖作用效果缓慢，时程长，在未达到预期效果时便终止实验而导致结果不明显；③本实验因为观测指标较少，具有一定的局限性；④实验动物数量可能不够，个体差异性导致实验结果不理想；⑤因为实验操作要求高，手术过程中的误差不可避免。接下来我们将会通过增加心电图、检测其他心肌特异性标志物等方法来观察羧甲基壳聚糖的保护作用能否随浓度递增而增强。

[参考文献]

[1] 张玉东. 微型钛板治疗口腔颌面骨折的临床效果[J]. 中国医药科学,2014,4(16):23-25.

[2] 张媛媛. pH值与Cl-浓度对纯钛及钴铬合金耐腐蚀性能的影响[D].长沙：中南大学,2012.

[3] 潘姜萍,董胜璋,陈成章. 钛对体外培养的大鼠及人肝、肾细胞的毒性初探[J]. 环境与健康杂志,1992,9(2):78-79.

[4] Jain A,Jain S,Jain R, et al.Coated chitosan nanoparticles encapsulating caspase 3 activator for effective treatment of colorectral cancer[J].Drug Deliv Transl Res，2015，5(6):596-610.

[5] 王林.EDTA-壳聚糖的制备及对Cd2+、Pb2+的吸附研究[D]. 湛江：广东海洋大学,2013.

[6] Kim J,Lin B,Kim S,et al.TGF-β1 conjugated chitosan collagen hydrogels induce chondrogenic differentiation of human synovium-derived stem cells[J].J Biol Eng， 2015，doi: 10.1186/1754-1611-9-1.

[7] 张华.英研究称体内植入钛合金仍存被腐蚀风险[J]. 中国钛业,2012,8(3):52.

[8] 孙万林.腹腔镜胆囊切除术后钛夹遗留腹壁切口内形成异物肉芽肿1例报告[J].腹腔镜外科杂志,2006,11(1):64.

[9] 吉晋芳.低分子量壳聚糖对镉引起的氧化损伤的保护作用[D]. 太原：山西大学,2008.

[10] 潘孝云,张先龙,毛昕，等.钛颗粒通过NF-κB信号通路上调炎症因子表达[J].浙江临床医学,2013,15(1):1-3.

[11] Wang W,Wu C,Tian B,et al.The inhibition of RANKL-induced osteoclastogenesis through the suppression of p38 signaling pathway by naringenin and attenuation of titanium-particle-induced osteolysis[J].Int J Mol Sci，2014，15(12):21913-21934.

[12] 贺斌,陶海鹰,卫爱林，等.p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路在羧甲基壳聚糖保护一氧化氮诱导软骨细胞凋亡中的作用及机制研究[J].中华风湿病学杂志,2013,17(8):552-556.

[13] Muanprasat C,Wongkrasant P,Satitsri S, et al.Activation of AMPK by chitosan oligosaccharide in intestinal epithelial cells: Mechanism of action and potential applications in intestinal disorders[J].Biochem Pharmacol，2015，96(3):225-236.

[14] 丁万军,刘世清,彭昊,等.羧甲基壳聚糖抑制白细胞介素-1β诱导的大鼠软骨细胞核因子-κB活化[J].中华风湿病学杂志,2010,14(9):602-605.

[15] Shu Y,Hao T,Yao F,et al.RoY Peptide-Modified Chitosan-Based Hydrogel to Improve Angiogenesis and Cardiac Repair under Hypoxia[J].ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(12):6505-6517.

[16] 魏雅楠. 羟丁基壳聚糖用于心血管支架涂层的研究[D]. 青岛：中国海洋大学,2013.

[收稿2015-09-25;修回2015-11-05]

(编辑：王静)

The protective effect of carboxymethyl chitosan for titanium particle-induced cardiotoxicity

YanZhu1,ZhangChongwei1,LongWenxin1,ZhangNan1,LuoYantao1,DongJun2

(1.Clinical Medical College of Changsha Medical University，Clinical Medicine Major of 2012 Grade Students,Changsha Hunan 410219,China；2. Department of Physiology，Basic Medical College of Changsha Medical University，Changsha Hunan 410219,China)

[Abstract]Objective To discuss the protective effect of carboxymethyl chitosan for titanium particle-induced cardiotoxicity.Methods thirty rabbits were divided into three groups randomly, treated with intramyocardial injection of normal saline, titanium particles and normal saline, titanium particles and carboxymethyl chitosan respectively. Lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase isoenzyme (CK-MB) activity were detected by spectrophotometer and ultraviolet spectrophotometer to observe changes in cardiac function, HE staining was used to observe pathological changes of heart tissues.Results Titanium particle significantly enhanced activity of LDH and CK-MB in serum(P<0.01) while carboxymethyl chitosan greatly decreased activity of LDH and CK-MB in serum (P<0.01).HE staining of cardiac muscle shows that titanium particles cause hydropic degeneration, lightly stained cytoplasm, unevenly stained nucleus, cell vacuoles and derangement of myocardial cells. Carboxymethyl chitosan greatly decreased titanium particles-induced cardiotoxicity.Conclusion Carboxymethyl chitosan did take effect in alleviating titanium particle-induced cardiotoxity to a certain extent.

[Key words]carboxymethyl chitosan；titanium particle；cardiotoxicity

[中图法分类号]R965

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0607-03

[通信作者]董俊，女，讲师，研究方向：药物对白血病增殖和分化的调控，E-mail:561463066@qq.com。

[基金项目]湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(NO：湘教通[2014]98-539)。