硒对病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用及其机制研究

硒对病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用及其机制研究

黎萍，郑百红*，潘薇，徐文静，许忠

(吉林大学第二医院 儿科， 吉林 长春130041)

病毒性心肌炎(VMC)是小儿心血管系统中最常见疾病。VMC临床表现轻重不一，部分急性VMC可导致心力衰竭或者严重的心律失常，严重威胁着儿童的身体健康[1]。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)能动员心肌组织中的多能心肌干细胞，并促进其增殖、分化，可补充病理状态下死亡的心肌细胞[2]。我们前期临床研究表明，硒可通过清除氧自由基，通过抑制脂质过氧化反应保护病毒性心肌炎小儿的心肌[3]。而硒是否能影响病毒性心肌炎小鼠心肌组织中IGF-1表达目前鲜有报道，本研究将以维生素C干预为对照，阐明硒干预对病毒性心肌炎小鼠的心肌保护作用以及对IGF-1表达的影响。

1材料与方法

1.1病毒及主要试剂

柯萨奇B3病毒(CVB3)的Nancy株由吉林大学基础医学院微生物教研室惠赠。本研究中所使用的CVB3半数组织感染量为100 TCID50/0.1 ml，-80℃保存备用。亚硒酸钠片为北京曙光药业有限责任公司生产，维生素 C为东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产。小鼠IGF-1的ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；兔抗小鼠IGF-1多克隆一抗为Bioworld 公司产品，组织裂解液和蛋白浓度测定试剂盒、HRP 标记的二抗均为上海碧云天公司产品。

1.2实验动物及分组

80只4周龄BALB/c雄性小鼠，随机分为4组：①正常对照(n=20)：连续3天腹腔注射不含病毒的培养液200 μl；②病毒对照组(n=20)：腹腔注射100 TCID50CVB3病毒液200 μl；连续3天；③维生素C对照组(n=20)：自接种病毒液当日(记为第0天)开始，给予200 mg·kg-1d-1的维生素C灌胃；④硒干预组(n=20)：亚硒酸钠， 剂量为 100 μg/kg ，每日1次。各组连续处理14天，并于第15天分别眼球后取血后断颈处死，同时取心脏，沿心纵轴眼科剪切开心脏，一半10%甲醛固定，待苏木素-伊红染色后行病理学检查，另外二分之一置于-80℃冰箱冻存。

1.3病理学检查

常规制作病理切片，经过苏木素-伊红染色后，在光镜下，每张切片随机取5个视野，心肌病变面积的计算公式为每个高倍视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积占整个视野面积的百分比，并依此判断心肌病理变化程度。无病变0分；病变面积小于25%记为1分，25%-50%记为2分，50%-75%记为3分；大于75%记为4分；最后计算心肌病变积分。

1.4ELISA法检测小鼠血清IGF-1水平

本研究采用美国Bio-tek，Instruments有限公司生产的ELX-800酶标仪、卡尔文生物科技有限公司生产的试剂盒检测小鼠血清IGF-1，比较各组间的IGF-1水平差异。

1.5Western blot 检测

采用组织裂解液裂解心肌组织，蛋白定量后，取30 μg总蛋白上样，电泳，湿转法转膜，封闭后，用封闭液1∶400稀释相应一抗后浸泡膜，洗膜，用封闭液1∶5000稀释相应的HRP标记的二抗后浸泡膜，ECL显影，以GIS数码凝胶成像系统分析蛋白杂交带光密度，IGF-1/β-actin代表IGF-1的相对表达量。

1.6数据分析

2结果

2．1小鼠生存率比较

实验无意外死亡。正常组小鼠状态良好，无死亡；病毒对照组小鼠第3天出现毛蜷缩，进食减少，激惹，体重增加缓慢，第6、7天分别死亡1只，第8天、第9天分别死亡1只，第12天、第13天分别死亡2只，14天生存率60.0%(12/20)。维生素C以及硒干预组小鼠14d生存率分别为80.0%(16/20)、 85.0%(17/20)。与病毒对照组比较，维生素C以及硒干预组生存率明显提高，有统计学差异(P<0.05)，维生素C对照组和硒干预组之间生存率无统计学差异(P>0.05)。

2.2心肌组织病理学改变

维生素C、硒干预组及病毒对照组小鼠心肌组织可见炎性细胞浸润，心肌纤维断裂和局灶性坏死，其中病毒对照组可见炎性细胞浸润呈片状及弥漫性，心肌纤维断裂和局灶性坏死，维生素C、硒干预组病变较病毒对照组轻，炎性细胞浸润少，坏死灶小且减少，如表1所示，组间差异有统计学意义(P<0.05)；而后两组之间无统计学差异(P>0.05)。正常对照组小鼠心肌组织未见明显病变。

表1　各组小鼠心肌病理积分及心脏重/体重比变化

注：*与病毒对照组及正常对照组比，P<0.01；△与正常对照组比，P<0.01；*之间比较：P>0.05。

2.3小鼠血清IGF-1水平检测

不同组别之间IGF-1水平详细数据见表2，可见病毒对照组小鼠的IGF-1水平显著低于正常对照组；维生素C对照组与硒干预组IGF-1水平显著高于病毒对照组，见表2。

表2　各组小鼠血清IGF-1水平

注：*与病毒对照组及正常对照组比，P<0.01；△与正常对照组比，P<0.01；*之间比较：P>0.05。

2.4Western blot法检测各组心肌IGF-1表达

图1为各组小鼠心肌组织的IGF-1蛋白电泳图，表3为IGF-1相对表达量及分析。与正常对照组相比，其他3组IGF-1表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；维生素C、硒干预组间IGF-1表达无显著差异(P>0.05)；与维生素C、硒干预组相比，病毒对照组的IGF-1表达明显降低，有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

CVB3感染所致VMC在儿科临床较为常见，其发病机制主要包括：CVB3的直接毒性作用，机体的免疫反应以及氧化作用等[4]。严重的急性VMC可导致心力衰竭或严重的心律失常，是小儿猝死的重要原因之一；部分患儿可发展成为慢性心肌炎，甚至进展为扩张型心肌病[5]。VMC也成为儿童后天性心脏病的主要病因，严重威胁着小儿的身体健康。

图1　各组小鼠心肌IGF-1蛋白电泳图

组别IGF-1正常对照组0.93±0.02 病毒对照组0.21±0.05△维生素C对照组0.62±0.15*硒干预组0.56±0.21*F9.34P<0.001

注：*与病毒对照组及正常对照组比，P<0.01；△与正常对照组比，P<0.01；*之间比较：P>0.05。

本研究表明，病毒对照组小鼠的心肌组织具有典型的病毒性心肌炎病理改变，而心肌IGF-1表达水平较正常对照组显著降低，提示IGF-1与病毒性心肌炎的发展有关。IGF-1高表达对心血管系统具保护作用。IGF-1作为一种高效生长因子，可促进心肌细胞DNA合成。研究表明，IGF-1高表达能通过提高一氧化氮合酶活性，发挥促进自由基清除、扩血管及干细胞动员等作用，还能通过抗心肌细胞凋亡作用及激活K+通道开放减少缺血再灌注损伤，发挥保护缺血性梗死心肌的作用[6]，另外，低IGF-1水平是心血管疾病一个独立危险因子，可增加心源性死亡的风险[2]。本研究表明，小鼠感染CVB3后，IGF-1表达下降；给予维生素C或者硒可使心肌细胞的IGF-1升高，减少心肌受损。

研究表明，硒能促进细胞再生，抗感染，清除自由基，改善心肌功能等多种生物活性[3，7]。本研究中硒干预组VMC小鼠与维生素C对照组比较，结果显示与病毒对照组相比，维生素C、硒干预组心肌病理改变均明显减轻，IGF-1表达均增加，有统计学差异。本研究维生素C、硒干预组间差异无统计学意义；提示硒对VMC心肌细胞具有保护作用。本研究结果显示，硒通过上调病毒性心肌炎小鼠的IGF-1表达，发挥了对病毒感染所致心肌损伤的保护作用。IGF-1是生长激素释放激素-生长激素-IGF-1轴的主要效应分子，硒是否通过该轴发挥心肌保护作用尚待进一步研究证实。

综上，硒可上调VMC小鼠的IGF-1表达，减轻CVB3病毒感染所导致的心肌损伤，本研究为硒在病毒性心肌炎的临床应用提供了实验基础和科学依据。

参考文献：

[1]Pankuweit S,Klingel K.Viral myocarditis：from experimental models to molecular diagnosis in patients[J].Heart Fail Rev,2013,18(6)：683.

[2]Troncoso R,Ibarra C,Vicencio JM,et al.New insights into IGF-1 signaling in the heart[J].Trends Endocrinol Metab,2014,25(3)：128.

[3]郑百红,毓明涛,郑百波,等.微量元素硒对急性病毒性心肌炎患儿脂质过氧化损伤的影响[J].吉林大学学报(医学版),2004,30(3)：437.

[4]马沛然,张仪.小儿病毒性心肌炎诊治研究进展和展望[J].中国实用儿科杂志,2008,23(10)：790.

[5]孙景辉,翟淑波.病毒性心肌炎发病机制的研究进展[J].临床儿科杂志,2012,30(7)：607.

[6]Akturk IF,Yalcin AA,Biyik I,et al.The role of insμlin-like growth factor-1 in development of coronary no-reflow and severity of coronary artery disease in patients with acute myocardial infarction[J].Postepy Kardiol Interwencyjnej,2014,10(1)：12.

[7]李岩,霍娇,吕晓华,等.硒多糖对小鼠免疫功能的影响[J].四川大学学报(医学版),2014,45(3)：512.

收稿日期：(2014-01-16)

文章编号：1007-4287(2015)03-0352-03

通讯作者*

基金项目：长春市科技局项目(2012-150-12SF78)