TSP-1与白血病相互关系的研究进展

王晓果 综述， 曾东风，孔佩艳 审校

(第三军医大学新桥医院血液科,重庆 400037)

·综 述·

TSP-1与白血病相互关系的研究进展

王晓果 综述， 曾东风，孔佩艳△审校

(第三军医大学新桥医院血液科,重庆 400037)

甲基化；白血病；TSP-1

白血病是一组异质性、克隆性的造血干细胞疾病,主要表现为造血干细胞不断积累的获得性遗传学异常,使其发生克隆性的突变，从而不能进行正常的自我更新、增殖和分化[1]。随着治疗手段的发展，白血病患者的预后明显改善，但是复发及感染并发症一直是急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者发病率和病死率居高不下的主要原因。急性白血病的发生包括了复杂的基因突变、缺失、癌基因激活及抑癌基因失活等多种分子生物学水平的异常。凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)，又称血小板反应蛋白-1(THBS1)是一种多功能ECM蛋白,在细胞增殖、凋亡、血管生成、炎症及免疫应答中起重要作用[2]。TSP-1的编码基因位于人类染色体15q15,全长约16 kb，含有22个外显子，读码框5.8 kb，是候选的抑癌基因。TSP-1基因启动子区域高甲基化抑制基因转录，与肿瘤及白血病的发生密切相关。TSP-1基因去甲基化治疗、针对TSP-1蛋白相关功能区域的靶向治疗为白血病治疗及感染并发症的预防提供了新的思路。本文对TSP-1基因启动子甲基化、TSP-1蛋白与白血病发生、发展、感染并发症等关系的研究现状进行综述。

1 TSP-1蛋白的结构和功能

TSP-1是一种首次在活化血小板中发现的细胞外基质(extracellula rmatrix，ECM)糖蛋白，是TSP家族研究最多的成分。TSP家族包括TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4、TSP-5。TSP-1在多种细胞中表达，包括脂肪细胞和巨噬细胞，是存在于ECM成分和条件培养基中的一种可溶性分子。TSP-1蛋白是一个大分子的同源三聚体，相对分子质量约145 KU，每个单体由1 152个氨基酸残基组成富含半胱氨酸的多肽；包括N-端区域；Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型重复序列；C-末端区域。不同的细胞表面受体通过连接TSP-1分子特定的区域发挥不同的生物学活性。CD36是TSP-1的一个受体，它连接到TSP-1的Ⅰ型重复序列参与信号转导，发挥黏附和抗血管生成作用。此外，还可激活天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)，从而诱导内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡[3]。TSP-1可参与止血、细胞黏附、迁移，ECM表达，生长因子活性调节等的创伤修复过程[4]。CD47结合TSP-1的C-端区域可参与β淀粉样蛋白炎性反应。并且有研究发现在T-淋巴细胞和慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)细胞中TSP-1和CD47/凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)相互作用诱导caspase非依赖性细胞死亡信号通路[5]。

2 TSP-1与白血病发生、发展的关系

2.1 TSP-1基因启动子高甲基化与白血病发病的关系 表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化。DNA甲基化改变是人类肿瘤中最常见的表观遗传学改变[6]。在DNA甲基化过程中,甲基化的CpG双核苷酸通过募集转录抑制因子、阻碍转录激活因子结合、改变染色质构象等途径抑制基因的表达。DNA 甲基化的改变被认为是细胞恶性转化的早期特征,表现为特殊基因的高甲基化伴随总体低甲基化。低甲基化促进癌基因活化；高甲基化则促使抑癌基因失活导致肿瘤发生。

血液系统恶性肿瘤的DNA甲基化多表现为广泛的低甲基化和局部基因启动子CpG岛的高甲基化，这种异常甲基化被认为是血液系统肿瘤的触发事件。Li等[7]发现TSP-1基因在CEM、RAJI细胞中完全甲基化，在Jurkat、K562、MOLT3、HL-60等多种白血病细胞株中发现TSP-1基因启动子的部分甲基化。Garcia-Manero等[8]在80例初诊的成人ALL患者发现TSP-1启动子甲基化频率11.3%。Greco等[9]对105例骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)，208例初治的AML，72例治疗相关的髓系肿瘤(therapy-related myeloid neoplasms，t-MN)基因启动子区域甲基化的研究发现，DAPK、CDH1、TSP-1基因在AML、MDS、t-MN中均发生甲基化。与初诊MDS、AML相比，t-MN患者中DAPK基因启动子区域甲基化频率更高，而TSP-1基因启动子区域甲基化频率在各组之间无显著差异。基因组甲基化与染色体缺失协同引起抑癌基因的沉默，可能是MDS进展为AML的主要表观遗传学改变。

2.2 TSP-1抑制骨髓微血管生成 TSP-1是一种内源性的血管生成抑制因子，肿瘤血管新生在白血病发生和发展中发挥着重要的作用。Kaur等[10]研究发现TSP-1通过干扰VEGFR-2与CD47结合，抑制VEGFR-2和AKT的磷酸化，阻断VEGFR-2的信号转导，从而抑制肿瘤血管生成。Okumura等[11]提出VEGF与VEGF受体结合激活PI3K/Akt信号通路，PI3K/Akt信号通过影响VEGF表达调节血管生成，同时PI3K/Akt信号可以抑制TSP-1。TSP-1蛋白还可与CD36分子、caspase-3、p59fyn及p38MAPK等分子结合，减弱内皮细胞生长和迁移，促进内皮细胞凋亡，从而发挥有力的抗血管生成效应。白血病的特征是白血病原始细胞在骨髓中不断积累的恶性肿瘤。骨髓血管生成对白血病的发生和骨髓微血管密度(microvessel density，MVD)增加具有重要作用。骨髓微血管密度在急性白血病(acute leukemia，AL)、慢性白血病(chronic leukemia，CL)、MDS中均有增加[12]。高燕[13]发现在白血病发病初期，TSP-1阳性率低，骨髓MVD显著升高；治疗缓解后，TSP-1阳性率升高，骨髓MVD降低。表明TSP-1表达与MVD呈负相关。白血病患者的骨髓和健康对照相比血管密度增加，提示白血病的进展可能会伴随着血管化增加。B细胞-慢性淋巴细胞白血病(B-cell chronic lymphoblastic leukemic，B-CLL)与健康对照相比血浆中TSP-1水平明显下降，而骨髓血管增加[14]。Shanafelt等[15]研究发现TSP-1水平较低的患者疾病进展时间缩短，表明血管生成增加与B-CLL临床进展相关。

2.3 TSP-1诱导白血病细胞凋亡 TSP-1与其受体CD36结合，激活caspase-3，从而诱导内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡。Li等[3]研究发现TSP-1诱导CD36阳性细胞株CHRF-288-11、Meg-01和HL-60的凋亡，但是不能诱导CD36阴性细胞株K562的凋亡。加入抗CD36抗体FA6-152或血小板生成素(thrombopoietin，TPO)可显著抑制TSP-1的效应。TSP-1也显著诱导B细胞-急性淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemic,B-ALL)的细胞凋亡，CD36阴性的细胞不易受TSP-1和FA6-152的影响。从而证实了TSP-1对白血病细胞表现了直接的诱导凋亡效应。Bruel等[16]发现全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)促进白血病细胞株HL-60和NB4分泌TSP-1，TSP-1可抑制2种细胞的生长，促进分化，诱导凋亡。在NB4细胞中TSP-1诱导凋亡的作用较ATRA强，但是TSP-1诱导的HL-60和NB4细胞的分化和凋亡与Bcl-2或Bax的表达改变不一致，表明和ATRA不同，TSP-1诱导HL-60和NB4细胞的分化不依赖于Bcl-2调节。同时发现位于TSP-1的NH2端和Ⅰ型重复序列的2种肝素结合肽(Hep-I和GGWSHW)能促进HL-60和NB4细胞的凋亡，表明细胞表面肝素分子可能参与TSP-1对早幼粒细胞的凋亡效应。ATRA能成功诱导大部分APL患者缓解，但耐ATRA复发是仍一个重要的问题。Saumet等[17]发现TSP-1除了在NB4细胞中表达外，在ATRA耐药的细胞株NB4-LR1中也有表达，同时TSP-1可诱导NB4-LR1细胞的凋亡。TSP-1诱导的NB4-LR1白血病细胞凋亡是以caspase非依赖性机制为特征，TSP-1分子的C-末端结构域由3型重复序列和C-末端球形区域组成，在白血病细胞中连接CD47和整合素αvβ3诱导caspase非依赖的细胞凋亡。TSP-1与CD47结合也可以诱导B-CLL中caspase非依赖性的细胞凋亡[18]。

2.4 TSP-1与感染并发症的关系 感染并发症一直是AML患者发病率和病死率的主要诱因。TSP-1是多功能蛋白，炎症时分泌到ECM，调节参与免疫的多种成分。近期多项研究表明感染发生时TSP-1与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)有一定的相关性。Schnetzke等[19]分析155例接受诱导化学治疗的AML患者TLR2和TLR4多态性，发现TLR4多态现象Asp299Gly和Thr399Ile是发展为败血症和肺炎的独立危险因素。证明了Toll样受体(TLR4和TLR2)多态性与AML感染并发症的危险性相关。Barcellini等[20]通过对95例B-CLL患者TLR4和TLR9基因表达的分析发现，B-CLL中TLR4和TLR9表达与感染、自身免疫和疾病恶化相关。TLR4减少的患者疾病恶化和自身免疫疾病进展的危险性增加。TSP-1激活巨噬细胞TLR4通路。Li等[21]研究发现TSP-1敲除小鼠的巨噬细胞可诱导炎症表现，提示TSP-1在激活巨噬细胞中发挥重要作用。后期用重组的人血小板TSP-1处理，能刺激骨髓诱导的巨噬细胞TNF-α表达。同时，TSP-1也可刺激TLR4表达和NF-κB活化。TSP-1介导的TNF-α生成增加在TLR4缺乏的巨噬细胞中消失，表明TSP-1通过TLR4通路激活巨噬细胞。TSP-1也刺激体内巨噬细胞TLR4活性。此外，用抗体阻断TSP-1和CD36之间的联系后，TSP-1调节的巨噬细胞活性减弱，表明TSP-1刺激的巨噬细胞通路部分上受TSP-1与CD36相互作用的调节。

3 TSP-1与白血病的诊断及治疗

研究表明TSP-1基因启动子区域CpG岛高甲基化在儿童肾透明细胞肉瘤(CCSK)[22]、类癌等肿瘤具有特异性，可作为此类肿瘤的特异性诊断标志。 Fleitas等[23]发现TSP-1表达与非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者的预后具有相关性。VEGF和TSP-1可作为进展期NSCLC预后评估的标志。TSP-1在白血病诊断及预后判断的研究相对较少。Shanafelt等[24]提出CLL细胞可以持续分泌TSP-1，临床上VEGF∶TSP-1比例可以预测CLL患者对免疫治疗的反应。提示了TSP-1在预测白血病治疗反应中有一定的意义。

TSP-1基因启动子异常甲基化具有可逆性，逆转启动子区域甲基化可以使沉默的基因重新表达。TSP-1基因CpG岛在RAJI、Jurkat、K562、MOLT3、HL-60等白血病细胞株存在高甲基化[8],经去甲基化药物地西他滨(5-aza-zdc)处理后其甲基化水平下降，TSP-1表达上调，细胞表现为生长抑制、分化和凋亡。刘澎等[25]将TSP-1重组腺病毒(ADV-TSP1)转染入K562细胞裸鼠体内，发现移植瘤的生长显著受抑。TSP1f重组腺病毒(ADV-TSP1f)通过抑制肿瘤细胞所处微环境内血管内皮细胞的增殖，降低血供，减少肿瘤生长刺激因子，从而达到抑癌作用。另外，TSP-1诱导CD36阳性的白血病细胞的凋亡，证实TSP-1对白血病细胞表现了直接的诱导凋亡效应，能够作为一种常规治疗的辅助方法被研究，尤其是对表达CD36或TSP-1其他受体的白血病细胞[3]。ATRA在调节细胞生长、分化和死亡方面有重要功能,TSP-1能调节生长抑制和死亡应答。TSP-1有助于提高APL对ATRA的治疗反应。TSP-1在ATRA耐药的APL治疗中具有一定的价值，最适合药物开发的TSP-1信号分子靶点的识别有待进一步探索[19]。

4 展 望

抑癌基因启动子甲基化是细胞癌变过程一个早期、频发事件，TSP-1基因启动子区域CpG岛甲基化与肿瘤及白血病的发生密切相关。TSP-1是一种多功能糖蛋白，在白血病中主要起抑制骨髓微血管生成、抑制白血病细胞生长，促进分化和凋亡的作用。近期研究发现TSP-1与TLR4相互作用与AML感染并发症有密切关系。深入研究TSP-1基因启动子区域CpG岛甲基化、TSP-1蛋白在白血病发生、发展中的相关机制,对于白血病的早期诊断、治疗及预后评估有着积极的意义。

[1]Döhner H,Gaidzik VI.Acute mgeloid leukemia in the age of genomics:Impact of genetic features on treatment decisions in AML[J].Hematology,2011,2011:36-42.

[2]Adams JC,Lawler J.The thrombospondins[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36 (6):961-968.

[3]Li K,Yang M,Yuen PM,et al.Thrombospondin-1 induces apoptosis in primary leukemia and cell lines mediated by CD36 and Caspase-3[J].Int J Mol Med,2003,12(6):995-1001.

[4]Lopez-Dee Z,Pidcock K,Gutierrez LS.Thrombospondin-1:multiple paths to inflammation[J].Mediators Inflamm,2011,2011(2):296069.

[5]Pettersen RD.CD47 and death signaling in the immune system[J].Apoptosis,2000,5(4):299-306.

[6]Lomberk G.Epigenetics[J].Pancreatology,2007,7(5/6):396-397.

[7]Li Q,Ahuja N,Burger PC,et al.Methylation and silencing of the Thrombospondin-1 promoter in human cancer[J].Oncogene,1999,18(21):3284-3289.

[8]Garcia-Manero G,Daniel J,Smith TL,et al.DNA methylation of multiple promoter-associated CpG islands in adult acute lymphocytic leukemia[J].Clin Cancer Res,2002,8(7):2217-2224.

[9]Greco M,D′alò F,Scardocci A,et al.Promoter methylation of DAPK1,E-cadherin and thrombospondin-1 in de novo and therapy-related myeloid neoplasms[J].Blood Cells Mol Dis,2010,45(3):181-185.

[10]Kaur S,Martin-Manso G,Pendrak ML,et al.Thrombospondin-1 inhibits VEGF receptor-2 signaling by disrupting its association with CD47[J].J Biol Chem,2010,285(50):38923-38932.

[11]Okumura N,Yoshida H,Kitagishi Y,et al.PI3K/AKT/PTEN signaling as a molecular target in leukemia angiogenesis[J].Adv Hematol,2012,2012:843085.

[12]Aguayo A,Kantarjian H,Manshouri T,et al.Angiogenesis in acute and chronic leukemias and myelodysplastic syndromes[J].Blood,2000,96(6):2240-2245.

[13]高燕．测定MVD、TSP-1在白血病中的临床意义[J]．中国医药指南，2010，8(30)：12-13．

[14]Go RS,Jobe DA,Asp KE,et al.Circulating endothelial cells in patients with chronic lymphocytic leukemia[J].Ann Hematol,2008,87(5):369-373.

[15]Shanafelt TD,Ramsay AG,Zent CS,et al.Long-term repair of T-cell synapse activity in a phase Ⅱ trial of chemoimmunotherapy followed by lenalidomide consolidation in previously untreated chronic lymphocytic leukemia (CLL)[J].Blood,2013,121(20):4137-4141.

[16]Bruel A,Touhami-Carrier M,Thomaidis A,et al.Thrombospondin-1 (TSP-1) and TSP-1-derived heparin-binding peptides induce promyelocytic leukemia cell differentiation and apoptosis[J].Anticancer Res,2005,25(2A):757-764.

[17]Saumet A,Slimane MB,Lanotte M,et al.Type 3 repeat/C-terminal domain of thrombospondin-1 triggers caspase-independent cell death through CD47/alphavbeta3 in promyelocytic leukemia NB4 cells[J].Blood,2005,106(2):658-667.

[18]Mateo V,Brown EJ,Biron G,et al.Mechanisms of CD47-induced caspase-independent cell death in normal and leukemic cells:Link between phosphatidylserine exposure and cytoskeleton organization[J].Blood,2002,100(8):2882-2890.

[19]Schnetzke U,Spies-Weisshart B,Yomade O,et al.Polymorphisms of toll-like receptors (TLR2 and TLR4) are associated with the risk of infectious complications in acute myeloid leukemia[J].Genes Immun,2015,16(1):83-88.

[20]Barcellini W,Imperiali FG,Zaninoni A,et al.Toll-like receptor 4 and 9 expression in B-chronic lymphocytic leukemia:relationship with infections,autoimmunity and disease progression[J].Leuk Lymphoma,2014,55(8):1768-1773.

[21]Li Y,Qi X,Tong X,et al.Thrombospondin 1 activates the macrophage Toll-like receptor 4 pathway[J].Cell Mol Immunol,2013,10(6):506-512.

[22]Ueno H,Okita H,Akimoto S,et al.DNA methylation profile distinguishes clear cell sarcoma of the kidney from other pediatric renal tumors[J].PLoS One,2013,8(4):e62233.

[23]Fleitas T,Martinez-Sales V,Vila V,et al.VEGF and TSP1 levels correlate with prognosis in advanced non-small cell lung cancer[J].Clin Transl Oncol,2013,15(11):897-902.

[24]Shanafelt TD,Byrd JC,Laplant B,et al.Pretreatment angiogenic cytokines predict response to chemoimmunotherapy in patients with chronic lymphocytic leukaemia[J].Br J Haematol,2009,146(6):660-664.

[25]刘澎，王一，杨仁池，等．腺病毒介导的凝血酶敏感蛋白1抗血管新生衍生物基因转移抑制K562细胞裸鼠体内生长[J]．中华医学杂志，2003，83(6)：485-488．

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.34.043

王晓果(1988-)，在读硕士，主要从事难治性白血病诊疗的基础和临床研究。△

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2015-07-10)