CAG-PLGC实验动物模型的回顾和评价

林钟宇，赵金媛，潘华峰，李海文，叶晓宪

(广州中医药大学，广东 广州 510006)

综 述

CAG-PLGC实验动物模型的回顾和评价

林钟宇，赵金媛，潘华峰，李海文，叶晓宪

(广州中医药大学，广东 广州 510006)

胃癌前病变；慢性萎缩性胃炎；动物模型

胃癌前病变(PLGC)是一个病理性概念，是指更容易发生癌变的组织病理变化，包括胃黏膜中、重度不完全性结肠型肠上皮化生(IM)和异型增生(Dys)，是从正常胃黏膜向胃癌转化过程中的一个重要阶段[1]。慢性萎缩性胃炎(CAG)，是以胃黏膜上皮和腺体萎缩，数目减少，胃黏膜变薄，黏膜基层增厚，或伴幽门腺化生和肠腺化生，或有不典型增生为特征的慢性消化系统疾病[2]，属于祖国医学中“痞满”“胃脘痛”“心下痞”“胃痞”范畴，就目前而言，出现胃癌前病变的绝大多数诱因是慢性萎缩性胃炎的进一步癌变发展，因此，世界卫生组织将其列为胃癌前状态。目前，医学界广泛认可这种由慢性浅表性胃炎→胃黏膜萎缩→肠上皮化生→异型增生→胃癌的发病模式[3]。而目前对该疾病研究主要是以建立各种CAG-PLGC动物模型为切入点和人为快速有效制作因素为主要介入手段，复制出CAG以及病理上肠腺化生、不典型增生等胃癌前病变的动物模型，对CAG的发病机制、预防胃癌的发生及阻断或逆转具有恶变潜能的胃癌前病变均具有重要的意义。但是，目前CAG-PLGC动物模型仍存在耗时长，耗资源多，技术参数较高等缺点，因此，寻找并建立更符合人类发病机制的动物模型是具有重要意义。本文就近年通过幽门螺杆菌(H.pylori)感染法、MNNG等化学致癌法、手术法、热盐水等物理损伤方法建立的CAG-PLGC动物模型研究进展进行回顾概述及评价反思，旨在为今后进一步完善CAG-PLGC动物模型及开展相关研究提供帮助。

1 各个实验动物造模方法介绍

1.1H.pylori感染引起的CAG-PLGC动物模型H.pylori是慢性胃炎、消化性溃疡等的重要病因，目前全球约有一半人数以上感染，它主要通过寄居在胃部感染引起胃黏膜炎症，并通过上述的慢性浅表性胃炎→胃黏膜萎缩→肠上皮化生→异型增生的发生机制使胃黏膜癌变最终导致胃癌[3]。此外，WHO也宣布H.pylori为微生物型的致癌物质，所以，建立由H.pylori感染引起的CAG-PLGC的动物模型更准备模拟人类感染H.pylori的机制是有必要的。

张荣光等[4]使用的是H.pylori菌株(NCTC11637)感染昆明小鼠(KM小鼠)模型。实验组每只小鼠灌喂H.pylori菌液200μL(含菌5×108CFU)，间隔2d，共感染3次。距末次灌喂菌液8周后, 处死所有小鼠后均发现实验组在胃部的H.pylori全部定植，且在病理学检查发现实验组胃黏膜有组织炎症反应并出现不同程度的萎缩。

曾志荣等[5]使用的是H.pylori菌株(Syndeystrain1,SS1)感染Wistar大鼠腺胃，使用布氏肉汤洗脱H.pylori菌落对实验组20只Wistar大鼠进行灌胃，1.5mL/只，连续5次，1周完成,而对照组动物则不作相应处理。4周时所有实验组动物胃窦、胃体产助检查均阳性,SS1主要定值于胃窦的胃小凹及腺腔,胃体较少且其定植量随感染时间的延长有增加的趋势,至24周时仍有明显定植；对照组动物未有H.pylori定植。病理组织学检查,4周时动物未见炎症反应,至8周、12周和24周胃窦及胃体出现轻至中度慢性活动性胃炎,在本实验周期内未见萎缩性炎症改变,对照组动物无炎症反应。

唐旭东等[6]根据上述造模方法进行改良，在模型实验组中每只灌胃抗生素混合溶液3d，第4天起给予吲哚美辛预处理，隔日大鼠灌胃50g/L碳酸氢钠溶液后灌胃H.pylori菌悬液6次。灌胃前后分别禁食12h及4h。间隔4周后大鼠灌胃水杨酸钠和乙醇混合溶液，灌胃前后1h禁食、禁水，共给药8周。结果发现模型实验组胃窦黏膜变薄，固有层腺体中度减少伴有中度慢性活动性炎症。这可证明采用H.pylori感染大鼠加上水杨酸钠与乙醇混合溶液灌胃的方法建立H.pylori感染CAG-PLGC大鼠模型。

1.2 以氨水为基础的综合性动物造模法 以氨水为主的CAG-PLGC动物模型造模法是指采取让SD或是Wistar大鼠自由饮用氨水，其目的是让动物在不同浓度氨水长期刺激下，可使胃黏膜的屏障破坏及腺体萎缩，且胃幽门窦萎缩得更明显，并伴有胃黏膜上皮细胞脱落和细胞增殖亢进，这就等同模拟在具有较强的尿素酶活性H.pylori的感染下，通过尿素酶水解尿素大量产生氨，在持续高氨状态下破坏胃部环境，造成胃部各部分组织不同程度的萎缩，同时也是对胃癌发生起助催化的作用。李秋娟等[7]用0.2mL/L的氨水作为日常饮用液体给予大鼠自由饮用16周,经病理证实胃窦组织部分有萎缩并有炎症反应，成功复制CAG-PLGC模型。

朱晓玲等[8]以自由饮用0.01%和0.025%氨水分别长期刺激大鼠胃部24周，成功造出CAG-PLGC模型并发现大鼠胃黏膜屏障的破坏、PAS阳性物质的减少及腺体的萎缩和部分上皮的肠上皮化生。

但是以单纯氨水刺激的动物造模已经不足以模拟人类多因素所致的CAG-PLGC，因此，在近十年来，许多学者在以自由饮用氨水的基础上再加上其因素成功制作模拟多因素致病的CAG-PLGC动物模型，苏剑东等[9]利用0.05%氨水自由饮用以及50 ℃脱氧胆酸钠(20mmol/L)，60%乙醇空腹灌胃刺激雄性Wistar大鼠胃黏膜24周经病理发现胃部腺体萎缩并有部分出现癌前病变，成功建立CAG-PLGC模型。刘希等[10]以0.1%氨水自由饮用再加上每周2次空腹60～70 ℃热盐糊、4 ℃冰盐水冷热交替灌胃和每周60%乙醇、常温20mmol/L脱氧酸钠和2%水杨酸钠混合溶液灌胃3次,三因素联合作用刺激SD大鼠胃黏膜24周并间断喂食,经过病理监测成功建立典型大鼠CAG-PLGC模型，有癌前病变倾向，但是癌变仍需要更多的时间继续造模。

1.3 以N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)法基础的综合性动物造模法MNNG是一种强力的化学致癌试剂，不依赖于酶的代谢作用，直接作用于胃肠道黏膜，其中致癌机制是直接靶定DNA而诱发细胞产生遗传毒性。以MNNG法为主的动物模型主要是模拟人类不当摄入硝酸盐在胃内转化为亚硝酸胺等致癌物质，作用于胃黏膜，从而引起胃黏膜萎缩，肠上皮化生甚至发生癌变，且经过反复国内外实验后，MNNG法是大家公认确切可致CAG、PLGC及胃癌的造模方法，所以单纯MNNG造成大鼠CAG-PLGC模型属于化学因素造模，在饮水中加入MNNG化学致癌剂给大鼠长时间自由饮用可诱发CAG和胃癌。通常单纯以MNNG法造模是以100～200μg/mLMNNG溶液让SD或是Wistar大鼠(以4～8周龄多见)进行自由饮用8～24周，病理上均可发现胃部(特别是胃窦区)黏膜腺体有不同程度的萎缩或消失并伴有明显炎性反应，局灶上有脱落、糜烂等，部分出现肠化生或不典型增生，在长时间刺激下，部分大鼠出现胃癌[11-13]。由这些指标可以得出成功复制出CAG-PLGC动物模型。

但是，使用MNNG单一因素制出动物模型的方法缺点较多：耗时长，造模使用的剂量、浓度和灌胃时间不一，自由饮用情况下也未实施排出动物是否存在自愈的倾向，单一因素对人类多因素所致CAG的模拟远远不够等。

因此，后人在寻求省时省力的造模方法上不断努力,希望从复合模型上寻求突破,结合多种手段弥补造模缺点。袁孝兵[14]认为MNNG应新鲜配制，避光保存，且浓度应控制在50～100μg/mL较为合理，浓度过低则模型复制时间过长，成功率低；浓度过高易出现结肠癌等其他肿瘤，魏玥等[15]建议使用120μg/mLMNNG溶液以5mL/(kg·d)灌胃代替自由饮用方式，以弥补动物饮水方面的随机性以防可能饮入的MNNG达不到预期效果。为了促进PLGC，在MNNG单药法基础上辅以理化药物损伤法，如无水乙醇、雷尼替丁、热糊及局部X射线照射等。谢晶日等[16]通过3组实验证明自由饮用MNNG和50%乙醇混合液并以热盐水和雷尼替丁混合灌胃同时配合饥饱失常(2d饱食，1d禁食)，在第11周就可以明显看肠上皮化生或异型增生，成功造出CAG-PLGC模型，诱变率72.23%，明显高于其他2组。

而在目前，国内大多研究主要是中医药对CAG-PLGC的作用机制及疗效等。因此，建立符合临床中医证型的动物模型是必不可少，同时也是让理论来指导实践。病证结合模型(兼有西医的病名，又符合中医的证型)是目前中医药在研究CAG-PLGC的特色。祖国医学中本病大多属于脾虚血瘀夹毒，曾进浩等[17]采用200μg/mLMNNG饮用液避光处理予以大鼠自用饮用，联合饥饱失常、耗气泻下法(小承气汤)连续造模18周，病理证明胃黏膜腺体有不同程度萎缩，成功复制脾虚证型CAG-PLGC动物模型。

徐珊等[18]在以MNNG单药法7周时间建立大鼠CAG的基础上分成3组，以苦寒泻下法(大黄煎剂)加饥饱失常法建立脾虚证候模型组，以钳子激怒法并每7d注射0.1%肾上腺素建立肝郁证候模型组，以湿热温度(33±2) ℃,相对湿度(95±3)%和喂养高糖高脂饲料的方法建立湿热证候模型组，均为4周，结果显示各模型组大鼠胃黏膜出现慢性炎症,各证候模型组中以脾虚CAG组大鼠胃黏膜炎症最重,各模型组大鼠胃黏膜厚度较正常对照组均有明显变薄,以脾虚CAG组大鼠胃黏膜厚度最薄,各个病证结合模型复制成功。

1.4 以手术法动物造模法 主要是利用手术方法使含有胆汁、肠液和胰液的十二指肠反流入胃，使其碱性物质长期直接损伤胃黏膜，引起胃黏膜炎症并伴有固有腺体萎缩，从而造成CAG。目前已有学者利用此原理成功施行大鼠胃空肠吻合术加十二指肠横断建立胆汁反流性大鼠CAG模型和通过开腹将金属弹簧植入胃幽门环诱发大鼠CAG模型等[19]。

2 各个实验动物造模评价

2.1以H.pylori为主的造模法 目前大多数建立H.pylori感染的CAG-PLGC的动物模型所使用的动物多为小鼠，采用国际公认的H.pylori致病性菌株是NCTC11637，对小鼠具有较强的感染性，并能引起与人体H.pylori感染类似的病理改变，且小鼠价格相对其他动物便宜，个人差异小，体内微生物易于控制，遗传背景明确，自发肿瘤低，具有一定的经济实用价值。 此外，也有少数学者采用大鼠的动物模型。虽然在实验周期内未见萎缩性炎症改变，但是研究表明Wistar大鼠对SS1H.pylori易感染且有大量定植，这为阐明H.pylori对大鼠也有一定致病性，打破之前大鼠不易定植的说法，长期维持该实验将有可能阐明H.pylori与胃癌的关系[19]。目前为了缩短造模时间，更多学者对该模型进行改良，加上乙醇或是非甾体类药物模拟人类生活中不良习惯所致疾病，符合该病变不仅仅是H.pylori感染，而是多病因致病的特点，同时，损伤胃黏膜也能够使H.pylori更快定植和入侵。可作为研究H.pylori感染CAG发病机制及药物干预治疗较合适的CAG-PLGC动物模型。该造模方法的缺点：造模时间长，模型存在一定不稳定性，需要新鲜的H.pylori菌株，必须反复筛选合适菌株，才可提高感染成功率，灌胃的菌量需经严格控制，灌喂菌量过低会降低细菌在小鼠胃黏膜定植的密度, 易致感染失败。若攻击菌量过高, 过量的细菌没能定植到胃黏膜上,在消化道内死亡、崩解,释放大量菌体成分,可能会引起消化道的病变。实验环境要求高，饲养条件苛刻，防止交叉感染，且新型改良模型报道较少，对其不足和缺点有待进一步了解。

2.2 以氨水为主的造模法 从以单一因素的造模到以氨水为主的复合多因素致CAG-PLGC动物模型造模方法是对传统氨水CAG-PLGC模型的创新，从氨水模型中加入模拟人类日常生活中饮食不当(饥饱失常、饮食冷热不均、高盐)、嗜酒、胆汁反流、滥用非甾体类药物、H.pylori感染等导致CAG的发病原因，从而建立大鼠CAG-PLGC模型。在相同的时间内，能够使大鼠胃部腺体大面积萎缩并且有部分出现肠化生现象，且该实验造模成功率高，稳定，成本低，不需要特殊设备和条件。该方法缺点：时间仍长，达到癌变时间仍长，胃黏膜萎缩程度比起同期使用致癌化学剂MNNG的作用要轻。本实验仍可作为CAG研究和药物研究筛选提供理论支持。

2.3 以MNNG为主的造模法 从单药MNNG法到MNNG结合多因素的造模法，大大缩短了大鼠CAG模型的造模时间,模型复制成功稳定,不易逆转，结合其他因素同时也注意了动态观察了各个阶段的病变情况，为成功造模与研究提供基础和实验数据，使动物病态模型愈加接近人类临床症状。在西医对CAG方面无特效药情况，中医药在防治癌变方面起重要作用，因此新药不断开发更需要建立这种创新型证候结合动物模型，以脾虚的造模方法为基础，根据研究需要添加不同的诱导因素，应该有较好的前景。该造模方法的缺点：虽然MNNG是公认的CAG造模试剂，但是MNNG试剂是一种有毒的强力致癌物质，对实验人员的健康和对实验环境有一定威胁，操作需谨慎。造模的成功与否大多都以病理学指标观察为依据，缺乏可定量实验性指标的检测，国际上也无公认标准。目前很多相关文献仅报道了造模成功案例，而在实验造模中动物的死亡仅是轻描淡写，未尽其详。因此，有魏玥[11]认为乙醇不宜与MNNG同用，在于乙醇产气较多，MNNG可致大鼠全消化道胀气，两者同用可加大大鼠在造模过程死亡率，建议饥饱失常法不宜与MNNG同用，在于空腹饮水会使MNNG加重对肠道黏膜刺激而减少胃黏膜刺激，从而增加MNNG致肠道肿瘤的几率。目前以MNNG为主结合多因素的方法较多，但没有统一，对其中的不足仍待进一步报道。

2.4 以手术直接操作为主造模法 此方法优点在于具有立竿见影的效果，适合研究胆汁反流在CAG发病的作用和机制。该造模方法的缺点：为防止组内有人为造成的差异性及获得较高成功率，其手术本身操作复杂，需要有较好的操作技术的工作人员参加，模型存在一定的不稳定性，需要时刻进行动态观察，相关文献报道较少，仍待进一步研究。

3 展 望

近几十年来，从最初单一的耗时、人力、物力等动物模型建立之时，许多学者都致力于寻找省时省力的造模方法，再研究人类CAG同时也模仿其病因来结合多种手段建立复合型动物模型。目前它的发展具有突出前景，能将中医基础理论和现代医学理论相结合，这为中药治疗CAG-PLGC疾病奠定了扎实基础，但研究病证结合的动物模型研究较少，缺乏更加科学和客观的观察指标，如何利用好名老中医及民间临床的经验，如何将临床路径和证候疗效评定形成统一量化标准等，都是在建立证候结合动物模型时时所必须探索的。

虽然CAG-PLGC动物模型复制新方法多样，但仍有不尽如人意之处，除了手术造模外，其他类型造模方法操作性相对而言较简易，但是成功造模实验周期都较长，消耗大量人力和物力，存在一定不稳定性，且造模试剂存在一定致癌性，这对工作人员和环境都有一定威胁。此外，笔者发现造模时间不应过长，特别在常温实验室而不是恒温实验室情况下，如采用氨水或是MNNG自由饮用的情况下，造模时间应该控制在夏秋期间让动物自由饮用，在实验过程中，若将自由饮用药物时间安排在冬春之间，温度较低，动物自身代谢低，饮水量会比夏秋的次数少，从而会造成造模时间过长或是造模失败。所以，实验者应根据自己的试验条件及对试验的要求来选择不同的造模方法,并研究出高成功率、稳定、经济理想、省时、简便易行等复制CAG-PLGC模型的方法,以促进对其的研究，切不可生搬硬套。

此外，任何动物模型实验只是一种间接研究,只可能在一个或几个方面与人类疾病相似。事实上,没有一种动物模型能完全复制出人类疾病的所有临床表现。因此,动物实验的结论正确与否,最终还必须在临床上人体实验得到直接实践，这样才具有现实意义。

[1] 陈伟,刘华一.中医药防治胃癌前病变机制的实验研究进展[J].天津中医药大学学报，2007，26(1)：54-56

[2] 魏玮等.中医对慢性萎缩性胃炎及胃癌癌前病变的研究概况[J].中华中医药杂志,2008,2(23):151-152

[3]CorreaP1,PiazueloMB.Thegastricprecancerouscascade[J].DigDis，2012,13(1):2-9

[4] 张荣光，段广才，范清堂，等.幽门螺杆菌感染的昆明小鼠模型的建立[J].中华医学杂志,2006,86(12):857-859

[5] 曾志荣，胡品津，陈旻湖，等.幽门螺杆菌长期感染大鼠腺胃模型的建立[J].中国人兽共患病杂志,1998,14(5):20-23

[6] 唐旭东，张翠萍，张琪，等.改良式Hp感染萎缩性胃炎大鼠模型的建立[J].青岛大学医学院学报,2012,48(3):247-249

[7] 李秋娟,仲来福,叶建新，等.大鼠实验性慢性萎缩性胃炎与胃黏膜生长抑素、胃泌素关系的研究[J].大连医科大学学报,1999,21(2):89-91

[8] 朱晓玲，多田正弘. 氨水对大白鼠胃黏膜长期作用的影响:胃黏膜屏障功能的变化[J].临床消化病杂志,1993,5(1):16-18

[9] 苏剑东,吴灵飞,蒲泽锦.慢性萎缩性胃炎动物模型的实验研究[J].汕头大学医学院学报,2007,20(2):88-90

[10] 刘希,王晶,王堃.氨水复合多因素建立萎缩性胃炎大鼠模型[C].第九次全国中药实验药理学术会议论文摘要汇编，2011：11-13；37-38

[11] 王茵萍,孙茂峰,范刚启，等.穴注黄茂、当归注射液对实验性慢性萎缩性胃炎胃黏膜血流的影响[J].针刺研究,2003,28(1):33-37

[12] 郑世华,林寿宁,罗和生，等.安胃汤对大鼠慢性萎缩性胃炎胃肠激素的影响[J].中国中西医结合消化杂志,2005,13(1):33-35

[13] 潘华峰,赵霞，鞠晓云，等.胃痞消对实验性大鼠慢性萎缩性胃炎的作用[J].中国中西医结合消化杂志,2005,13(5):287-289

[14] 袁孝兵.大鼠胃癌前病变模型的研究进展[J].安徽中医学院学报,2004,23(5):62-64

[15] 魏玥,杨晋翔,李志钢，等.MNNG胃癌前病变大鼠造模联合因素的探讨[J].中国中西医结合消化杂志,2011,19(2):111-112

[16] 谢晶日,王业莉, 张扬，等.复合造模法建立大鼠胃癌前病变模型的实验研究[J].中华中医药学刊,2013,31(11):2341-2342

[17] 曾进浩,潘华峰，胡霞，等.胃痞消对胃癌前病变大鼠胃黏膜上皮细胞NF-κBp65信号表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(9):145-149

[18] 徐珊,周嘉鹤,王常松，等.慢性萎缩性胃炎证病结合模型的复制[J].中国中医药科技,2008,15(1):6-8

[19] 张国梁,李艳.慢性萎缩性胃炎动物模型研究进展[J].中国中西医结合消化杂志,2012,20(12):567-569

潘华峰，E-mail：gzphf@126.com

国家自然基金资助项目(81473620)；广东省联合培养研究生示范基地人才培养项目(AIAFD004132A15)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.15.040

R-332

A

1008-8849(2015)15-1699-04

2014-09-01