鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗不同佐剂的免疫效果试验

曹　绘，李宝臣，李　漫，方维焕

(1.浙江大学动物预防医学研究所，浙江杭州 310058；

2.浙江诺倍威生物技术有限公司)



鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗不同佐剂的免疫效果试验

曹绘1，2，李宝臣2，李漫2，方维焕1

(1.浙江大学动物预防医学研究所，浙江杭州 310058；

2.浙江诺倍威生物技术有限公司)

摘要：为评价鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗不同佐剂的免疫效果，选用Marcol 52、T1和SNB白油及S71油佐剂与鸡新城疫病毒和禽流感病毒混合制成灭活疫苗，免疫适龄SPF鸡，比较不同佐剂对鸡的安全性及新城疫和禽流感的血凝抑制(HI)抗体水平。结果表明，4种佐剂疫苗的安全性、稳定性良好；应用T1白油佐剂的灭活疫苗，免疫SPF鸡产生的新城疫和禽流感HI抗体水平优于其他佐剂，免疫后2周检测新城疫和禽流感的抗体水平均合格，确定为最佳白油佐剂。

关键词：鸡新城疫；禽流感；灭活疫苗；佐剂优化

鸡新城疫(ND)是危害养鸡业的主要传染病之一，是一种急性高度接触性传染疾病，发病率和死亡率极高[1]。禽流感(AI)是由A型流感病毒(AIV)引起的烈性传染病，H9亚型禽流感病毒感染鸡群后，除了引起呼吸系统疾病，还影响生殖系统[2]。鸡新城疫和禽流感是一种世界范围的禽类疫病，给禽业生产造成巨大的经济损失，免疫接种是控制鸡新城疫和禽流感的有效方法。但是，如将鸡新城疫和禽流感H9亚型疫苗分别接种，不仅工作量大，且对鸡体应激严重，故迫切需要生产能“一针防多病”的疫苗，鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗则成功地解决了这一问题。

目前，鸡新城疫和禽流感(H9亚型)灭活疫苗大多采用白油作为佐剂，司盘80和吐温80作为乳化剂[3-4]。由于不同厂家白油佐剂制备和纯化工艺的差异，筛选出免疫效果好、安全性高的油佐剂对鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗产品质量的提升有着重要意义。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1抗原鸡新城疫病毒抗原和禽流感病毒(H9亚型)抗原由浙江诺倍威生物技术有限公司生产并提供(详见表1)。

1.1.2佐剂选用Marcol 52、T1和SNB三种白油佐剂，S71油佐剂(详见表2)。

表1　鸡新城疫病毒抗原和禽流感病毒

表2　佐剂来源及产品型号

1.1.3主要器材FA25 model乳化剪切机，IPQ-3禽用隔离器等。

1.1.4实验动物30-60日龄SPF鸡和21-35日龄SPF鸡，均由浙江诺倍威生物技术有限公司质量管理部动物房提供。

1.2试验方法

1.2.1病毒液的灭活及灭活检验将制备所得的两种病毒液分别加入适量灭活剂进行抗原灭活，并按照2010年版《中华人民共和国兽药典》第三部进行灭活检验[5]。

1.2.2疫苗制备将检验合格的新城疫病毒液和禽流感病毒液按照1∶1比例混合，再将混合后的病毒液与佐剂按照1∶2比例乳化后制成疫苗。将使用Marcol 52、T1、SNB和S71佐剂制成的灭活疫苗分别命名为A、B、C、D疫苗组。

1.2.3无菌检验根据《中国兽药典》附录所提供的方法进行检验，取样品1 mL接种于含有50 mL硫乙醇酸盐的培养基中，37℃培养72 h，将培养物移植至TG小管和GA斜面各两支(0.2 mL/支)，1支在37℃培养，1支在25℃培养，另取1支GP在25℃培养，观察7 d。

1.2.4性状检验各组灭活疫苗按照《中国兽药典》进行性状检验。

1.2.5安全检验选用30-60日龄SPF鸡10羽，每羽颈部皮下注射疫苗0.1 mL，观察14 d内有否出现因疫苗引起的局部和全身性不良反应。

1.2.6效力检验

1.2.6.1新城疫效力检验选用30-60日龄SPF鸡15羽，其中10羽每羽皮下注射疫苗0.2 mL，另5羽作为非免疫对照。免疫后21-28 d，每羽分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。

结果判定：免疫组HI抗体效价不低于1∶16(微量法)，对照组不高于1∶4(微量法)。

1.2.6.2禽流感效力检验选用21-35日龄SPF鸡15羽，其中10羽每羽皮下注射疫苗0.2 mL，另5羽作为非免疫对照。免疫后21-28 d，每羽分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。

结果判定：免疫组HI抗体效价不低于1∶64(微量法)，对照组不高于1∶4(微量法)。

2结果与分析

2.1疫苗检验结果详见表3、表4。

表3　不同油佐剂鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗性状检验

表4　不同油佐剂鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗安全性检验

由表3和表4可见，各组灭活疫苗的灭活检验、无菌检验、性状检验、安全检验均符合国家标准。注射部位无过敏反应及局部不良反应，疫苗吸收良好，未见形成肉芽组织。

2.2动物试验结果详见图1、图2。

图1　不同油佐剂鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫后新城疫HI抗体比较

图2　不同油佐剂鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫后禽流感HI抗体比较

由图1可见，新城疫抗体B组最高、免疫后14 d抗体水平检测合格，21 d后4种油佐剂的抗体均值分别为1∶74、1∶111、1∶26和1∶26，均达到合格标准，但C组和D组相对较低。

由图2可见，禽流感抗体B组最高、免疫后14 d抗体水平检测合格，21 d后4种油佐剂的抗体均值分别为1∶891、1∶2353、1∶446和1∶1552。通过对比不同时间的抗体水平，以T1为佐剂的B组灭活疫苗抗体水平最高，D组次之，A组和C组虽然符合国家标准，但抗体水平较低。

3小结与讨论

免疫佐剂是指与抗原同时或先于抗原使用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的物质[6]。选择佐剂时不仅要考虑其免疫促进作用，也要兼顾佐剂的安全性及佐剂与抗原适当比例配制后疫苗的黏度、稳定性等是否符合要求。

目前，灭活疫苗尤其是禽用灭活疫苗，通常使用的佐剂是矿物油佐剂，抗体滴度维持时间较长。但是，不同油佐剂对疫苗免疫效果的增强作用可能存在差异[7-8]，本试验选择了4种进口油佐剂，分别与鸡新城疫和禽流感(H9亚型)病毒液配制成灭活疫苗，免疫接种适龄的SPF鸡均未出现局部肿块及不良反应，说明4种佐剂的生物兼容性较好，易吸收，无毒副作用。

经试验，4种进口油佐剂配制的鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗免疫适龄的SPF鸡进行效力检验结果显示，不同佐剂制备二价灭活疫苗的抗体效价确实存在明显差异，只有T1作为佐剂的疫苗，免疫后2周抗新城疫病毒和流感病毒的抗体均可达到合格水平，其余佐剂则在免疫3周后才能达到合格水平。笔者认为T1白油是鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的理想佐剂。

通过对不同佐剂的筛选来提高现有灭活疫苗的抗体水平和免疫保护效果具有重要的现实意义，以T1为佐剂的鸡新城疫和禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的实际应用效果有待进一步验证试验。

参考文献

[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].北京.中国农业出版社，1980:352.

[2]戚中田.禽流感病毒与人类禽流感[J].中国科学基金，2004,2:68-71.

[3]王学艳. NDV分离株F及HN基因的遗传变异分析与核酸疫苗质粒的构建[D]. 西北农林科技大学,2008.

[4]李呈军. 中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究[D]. 中国农业科学院,2005.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国兽药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010:21-22.

[6]高泽乾，孙建男，武炜，等.兽用免疫佐剂研究进展[J].唐山师范学院学报，2012,34(2):45-51.

[7]丛秋实,胡瑞鸿,郑德富,郑孝辉,姜丽萍.禽流感(H9)灭活疫苗白油佐剂的优选试验[J]. 中国动物保健,2013(10)：10-12.

[8]施建春,杨惠萍,. 不同佐剂的新城疫疫苗免疫效果的研究[J]. 山西农业大学学报(自然科学版),2014(6)：23-25.

中图分类号：S858.31

文献标识码：A

文章编号：1005-7307(2015)06-0001-003

收稿日期：2015-09-18