高效液相色谱法测定人血浆中依托咪酯的浓度

张海峰 马爱玲 王漪檬 修 佳 赵红卫 秦玉花 赵宁民

河南省人民医院药学部，河南郑州 450003

依托咪酯是目前最常用的静脉全麻药，由于该药具有代谢快、蓄积少、苏醒快等优点而被广泛用于麻醉诱导与维持[1]。本研究拟建立人血浆中依托咪酯的检测方法学并验证方法学的可靠性。

1 资料与方法

1.1 仪器

Waters 1525 高效液相色谱仪，Waters 2489 紫外检测器，AUW120D 电子天平（日本岛津），WH-866 旋涡混合器，TL-420D 型电控多用恒温水箱，上海800 型离心沉淀器。

1.2 试药

依托咪酯对照品（江苏恩华药业股份有限公司，批号：20121001，含量：99.9%）；甲醇为色谱纯；二氯甲烷为分析纯；水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水（75 ∶25），流速：1.0mL/min；检测波长：241nm；柱温：室温；进样量：20μL。

2.2 标准溶液的制备

准确称取依托咪酯对照品5.0mg，置100mL 量瓶，用甲醇溶解并定容，制备成浓度为50μg/mL 的依托咪酯对照品贮备液。依次量取50μg/mL 的依托咪酯对照品贮备液适量，用甲醇稀释成2.5、5、10、20、40、50μg/mL 的标准系列溶液。

2.3 血浆样品的处理

取空白血浆500μL 于10mL 具塞试管中，准确加入500μL 依托咪酯标准溶液，混合后，加入5mL二氯甲烷，漩涡混匀1min，3000r/min 离心5 min，取下层液4mL 于5mL 尖底试管中，在40℃水浴中用轻柔空气吹干，用200μL 甲醇溶解，3000r/min 离心5min，取20μL 上清进样分析。

2.4 专属性试验

取空白血浆500μL，按“2.3”项下方法处理并进样检测作为空白溶液色谱图；平行取空白血浆500μL，加入依托咪酯标准溶液，按“2.3”项下方法处理并进样检测作为空白血浆加对照品色谱图；取手术病人依托咪酯0.6mg/kg 静脉点滴给药10min后动脉血，置于EDTA 抗凝管中，血浆样品按“2.3”项下方法处理并检测作为患者血浆样品色谱图，记录色谱图见图1。依托咪酯保留时间约5.5min，色谱峰峰形良好，血浆内源性物质不干扰样品测定，本方法具有较高的专属性。

图1 人血浆中依托咪酯HPLC 色谱图

2.5 线性关系考察

取空白血浆500μL 于10mL 具塞试管中，分别加 入50μL 浓 度 为2.5、5、10、20、40、50μg/mL 的 标准系列溶液，配置成浓度为0.25μg/mL、0.5、1.01、2.0、4.0、5.0μg/mL 的依托咪酯血浆对照品，按“2.3”项下方法处理，取20μL 进样分析。以依托咪酯的血浆浓度作为横坐标，依托咪酯的峰面积作为纵坐标，峰面积y 对浓度x 作线性回归，线性方程为y=39285x-5124.6，r=0.9987，线性范围为0.25 ～5.0μg/mL。

2.6 精密度试验

取空白血浆500μL，分别加入依托咪酯标准系列溶液，配置成浓度为0.5、1.0、4.0μg/mL 的血浆对照品，按“2.3”项下方法处理，取20μL 进样分析。每个浓度连续进样5 次，计算RSD 作为日内精密度；5 天内每天测定1 次，计算RSD 作为日间精密度，结果见表1。

2.7 回收率试验

取空白血浆500μL，分别加入依托咪酯标准系列溶液，配置成浓度为0.5、1.0、4.0 μg/mL 的血浆对照品，每个浓度平行制备3 份，按“2.3”项下方法处理，取20μL 进样分析。用回归方程计算检出量，并与加入量比较，计算方法回收率，结果见表2。

表1 人血浆中依托咪酯精密度结果（n=5）

将空白血浆500μL 换成流动相，同法配制上述3 种浓度的依托咪酯溶液，每个浓度平行制备3份，按“2.3”项下方法处理，取20μL 进样分析。将同浓度血浆样品和流动相制备的样品峰面积进行比较，计算提取回收率，结果见表2。

表2 人血浆中依托咪酯回收率结果（n=3）

2.8 稳定性试验

取空白血浆500μL，分别加入依托咪酯标准系列溶液，配置成浓度为0.5、1.0、4.0μg/mL 的血浆对照品，每个浓度平行制备3 份，放置于-30℃低温冰箱保存，分别于第7 天、15 天、30 天取出血浆对照品，按“2.3”项下方法处理，取20μL 进样分析。结果各浓度的RSD 均小于4.1%，表明血浆中依托咪酯-30℃低温冰箱保存30d 稳定性好。

3 讨论

依托咪酯制剂中依托咪酯的含量测定方法，国内已有多篇文献报道[2-6]，但存在检测速度慢、操作复杂等缺点。血浆中药物浓度的检测方法和制剂中药物浓度的检测方法有较大不同，本研究拟建立人血浆中依托咪酯的检测方法学。

文献检索发现：血浆中依托咪酯的含量测定方法国外已有多篇文献报道[7-11]，国内仅有一篇文献报道[12]。本实验建立的高效液相色谱法采用甲醇-水（75 ∶25）为流动相，流动相配置简单，样品出峰快，出峰时间大约在5.5min，该方法简便、快捷、准确、可靠，更适用于人血浆中依托咪酯浓度的测定。

本研究预实验采用了沉淀蛋白法进行血浆样品预处理，分别采用400μL 甲醇、乙腈等有机溶剂沉淀蛋白后，取上清进样。但是检测灵敏度达不到临床要求。在上述方法的基础上，沉淀蛋白后取上清500μL，空气吹干，用100μL 甲醇复溶浓缩后进样，但是灵敏度还是不够，因此沉淀蛋白法不适用本研究。正式试验改用了液液萃取法，取得了良好的效果。由于依托咪酯极易溶于三氯甲烷，所以本试验选择了毒性较小的二氯甲烷作为萃取溶剂，结果表明，提取回收率与灵敏度均符合要求。

本试验在前期研究基础[3]上优化了色谱条件是，采用甲醇-水为流动相，优化其比例为75：25，室温条件下，检测波长为241nm，流速为1.0mL/min，依托咪酯在5.5min 出峰。血浆内源性物质不干扰样品测定，具有较好的专属性。改进后建立的HPLC 法简便准确，专属性及重现性良好，可用于药代动力学研究。

[1] 马爱玲，张海峰，赵宁民，等.丙泊酚注射液与依托咪酯脂肪乳注射液的配伍稳定性研究[J].中国医院药学杂志，2013，33（21）：33-35.

[2] 胡德福，王荣梅.HPLC 测定依托咪酯注射液的含量[J].山东医药工业，2001，20（1）：15-16.

[3] 宋妍，马爱玲.HPLC 法测定依托咪酯脂肪乳注射液中依托咪酯的含量[J].中国医药指南，2013，11（17）：84-85.

[4] 王发，张秉华，郭欢迎，等.HPLC 法测定依托咪酯注射液的含量及有关物质[J].西北药学杂志，2010，25（4）：253-255.

[5] 宋妍，马爱玲.HPLC 法测定依托咪酯脂肪乳注射液中依托咪酯的含量[J].中国医药指南，2013，5（17）：84-85.

[6] 王发，张秉华，郭欢迎，等.HPLC 法测定依托咪酯注射液的含量及有关物质[J].西北药学杂志，2010，25（04）：253-255.

[7] Zawisza P1，Przyborowski L.High-performance liquid chromatographic determination of propanidid and etomidate[J].Acta Pol Pharm，1992，49（5-6）：11-13.

[8] McIntosh MP，Rajewski RA.A simple and efficient highperformance liquid chromatographic assay for etomidate in plasma[J].J Pharm Biomed Anal，2001，24（4）：689-694.

[9] Le Moing JP，Levron JC.High-performance liquid chromatographic determination of etomidate in plasma[J].J Chromatogr， 1990， 529（1）：217-22.

[10] 胡德福，王荣梅.HPLC测定依托咪酯注射液的含量[J].山东医药工业，2001，20（1）：15-16.

[11] 蔡梅，严菲，蔡美明.气相色谱法测定依托咪酯注射液中丙二醇的含量[J].药学与临床研究，2010，18（2）：191-192.

[12] 阎克里，朱秀卿，赵丽，等.HPLC 法测定人血浆中依托咪酯的浓度[J].药物分析杂志，2010，30（6）：1125-1128.