2013年陕西市售水产品中孔雀石绿和结晶紫的检测

张艺蓓，岳田利，乔海鸥，贾 如，蒋旭鹏，李 璐

(1 西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100； 2 陕西省疾病预防控制中心 理化检验室，陕西 西安 710054)

2013年陕西市售水产品中孔雀石绿和结晶紫的检测

张艺蓓1，岳田利1，乔海鸥2，贾 如1，蒋旭鹏1，李 璐1

(1 西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100； 2 陕西省疾病预防控制中心 理化检验室，陕西 西安 710054)

【目的】 对2013年陕西省市售水产品中的4种兽药残留进行检测研究，为保证当地食品安全提供参考。【方法】 随机抽取16种购自陕西省10个地市批发市场的120份鱼样品，采集鱼样可食部分匀浆后用乙腈提取，经中性氧化铝净化，采用超高效液相色谱-串联质谱法对兽药孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物隐性孔雀石绿、隐性结晶紫的残留情况进行检测和定性、定量分析，统计4种兽药残留的总检出率、16种样品中兽药残留的检出率、10个地市兽药残留的检出率、4种兽药残留的平均水平及同一样品中4种兽药的混配使用情况。【结果】 16种120份鱼肉样品中4种兽药的总检出率为4.6%，其中隐性结晶紫未检出；120份鱼肉样品兽药残留的样品检出率为15.8%，其中梭边鱼、鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼和草鱼兽药残留的检出率分别为100.0%，100.0%，33.3%，15.4%和11.8%，高于2011年的全国平均水平(9.0%)，其余11种鱼样中未检出兽药残留；除榆林外的9个地市市售鱼样中均检出兽药残留，其中商洛、咸阳的检出率最高，均为10.4%；来自商洛的鲶鱼样品同时检出多种兽药残留，说明商洛存在多种兽药混配使用现象。【结论】 陕西省市售水产品中4种兽药残留的总检出率并不高，但市场占有率较高的鲤鱼、鲶鱼、草鱼样品中均有兽药残留，且检出率均较高；10个地市中有9个地市市售水产品中均有兽药检出，且存在多种兽药混配使用情况，对人体健康具有潜在威胁，应当引起重视。

水产品；孔雀石绿；结晶紫；兽药残留检测；陕西省

孔雀石绿(Malachite green,MG)和结晶紫(Crystal violet，CV)属于三苯甲烷类物质，是纺织工艺中使用的染料，曾因其具有消毒和杀菌作用而在水产养殖和运输过程中作为驱虫剂和杀菌剂使用，以防治鱼类水霉病、烂腮病及寄生虫病，延长鱼类的存活时间[1]。MG是一种带有金属光泽的绿色结晶体，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷(Triphenylmethane)，化学式为C23H25ClN2，易溶于水、甲醇、乙醇和戊醇，水溶液呈蓝绿色。CV是一种带有金属光泽的深绿色固体，化学式为C25H30ClN3，与孔雀石绿的结构相似。二者进入生物体内后，可以通过生物转化还原成毒性更大的隐性代谢产物如隐性孔雀石绿(Leuco malachite green,LMG)和隐性结晶紫(Leuco crystal violet,LCV)[2]。这两种隐性代谢物具有较高的亲脂性，在鱼类脂肪组织中代谢速度极慢，易形成稳定的残留，有明显的蓄积现象[3-6]。研究发现，MG、CV、LMG、LCV的化学官能团——三苯甲烷是一种致癌物质，具有高毒、高残留的特性，可通过食物链对哺乳动物和人类产生“三致”作用，对生物体组织、生殖、免疫系统均有影响[7]。目前，这类兽药大范围使用的原因主要有两个：一是其价格低廉，抗菌效果好；二是在治疗鱼类水霉病方面药物种类有限，尚未有理想的替代品[8]。

目前，美国、加拿大、日本和欧盟的许多国家都将MG和CV列为渔用禁用药物[9]。2001年，中国在《无公害食品渔用药物使用准则》(农业行业标准NY 5071-2001)中将MG列为渔用禁用药物；2002年，农业部同时将MG和CV列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。自2006年开始，我国湛江[10]、珠海[11]、宁波[12]、武汉[13]、福建[14]、湖北[15]和深圳[16]等地区陆续报道了水产品中MG的残留情况，只有湛江出口水产品未检出MG，其余几个城市的检出率为6.5%～23.2%。陕西省地处内陆腹地，水产养殖业并不发达，但却是水产消费大省，草鱼、鲢鱼、鲫鱼、罗非鱼为当地主要的养殖鱼类。自2011年开始，我国将养殖鱼中MG及其代谢物的监测列入国家食品安全风险监测计划，陕西省也开展了养殖鱼中MG和CV的检测工作。

对于MG和CV的检测，有许多不同的方法，如高效液相色谱法、共振瑞利散射法、同位素内标测定法和薄层色谱法、液相色谱-线性离子阱质谱法、液相色谱-荧光检测器法或液相色谱-质谱法等[17-21]。但这些方法的灵敏度、选择性和分析通量还存在不足之处，高效液相色谱对样品的净化要求高，操作步骤繁琐、耗时长，不利于准确定性和定量。而超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)是近年来发展起来的一种新技术，采用三重串联四极杆质谱或离子阱作为检测器，代替高效液相色谱的紫外检测器，可发挥液相色谱较快的分析速度、高分离度与串联质谱的高选择性、高灵敏度的优势，能较好地进行目标化合物的定性和定量分析。

本研究通过随机抽样和定点抽样，采用高效的UPLC-MS/MS方法，对陕西省10个地市市售水产品中MG、CV及其代谢物的残留进行检测，并进行溯源分析，以了解陕西省市售水产品的安全状况，并为化学污染物的暴露评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

UltiMateTM3000超高效液相色谱仪，美国Dionex公司；API-3200三重四极杆质谱仪，美国Applied Biosystems公司。

孔雀石绿标准品(MG)、隐性孔雀石绿标准品(LMG)、结晶紫标准品(CV)、隐性结晶紫标准品(LCV)、孔雀石绿内标标准品(d5-MG)、隐性孔雀石绿内标标准品(d6-LMG)、结晶紫内标标准品(d5-CV)、隐性结晶紫内标标准品(d6-LCV)，纯度99%,美国Sigma-Aldrich公司；甲酸、乙腈、乙酸铵，色谱纯,德国Merck公司；中性氧化铝萃取小柱，美国Supelco公司；Millipore A10纯水系统，美国Millipore公司。

1.2 样品来源与处理

1.2.1 采 样 根据全国食品污染物监测网中规定的监测项目和监测种类，结合陕西省经济发展水平、地域特征和人口分布情况，在西安、宝鸡、安康、延安、咸阳、渭南、商洛、铜川、汉中和榆林共选取10个监测点，采用随机抽样和定点抽样相结合的方法，对每个监测点随机选择2个农贸市场进行随机采样。抽样品种涵盖草鱼、鲤鱼、鲫鱼等当地市场上销售的市民大宗食用鱼类共16个品种120份样品。采样后立即密封并及时运回实验室冷藏。各地市采样品种及数量见表1。

1.2.2 样品提取和净化 取鱼样可食部分匀浆，准确称取5 g样品于50 mL塑料离心管中，添加50 μL混合同位素内标中间液，加入提取液乙腈25 mL，涡旋混合2 min，10 000 r/min离心10 min，收集上清液于100 mL玻璃离心管中，待净化。

用5 mL乙腈活化中性氧化铝萃取小柱，在氮吹仪上用氮气吹干；取5 mL上清液，加载在中性氧化铝小柱上，收集滤液，再用4 mL乙腈淋洗小柱，再收集滤液，将2次滤液合并；在氮吹仪上于50 ℃用氮气吹至近干，用乙腈水溶液(V(乙腈)∶V(水)=50∶50)溶解残渣，并定容至0.5 mL，0.22 μm膜过滤，液质联用仪上机检测。

1.3 检测条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Dionex Acclaim®RRSLC C8(2.1 mm×100 mm，2.2 μm)；流动相A为乙腈，流动相B为含体积分数0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样体积10 μL。

1.3.2 质谱条件 电喷雾ESI离子源(正离子)；扫描方式为多反应监测(MRM)；电喷雾电压5 500 V；气帘气压力137.9 kPa；雾化气压力275.8 kPa；辅助气压力275.8 kPa；离子源温度450 ℃；碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞室入口电压(CEP)、碰撞室出口电压(CXP)等参数见表2。

1.4 标准溶液的制备

(1)标准储备液(1 mg/mL)。精确称取MG、LMG、CV、LCV标准品10 mg分别置于4个10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，-18 ℃保存。(2)混合标准工作液(100 ng/mL)。分别准确移取1 mg/mL的MG、LMG、CV、LCV标准储备液0.1 mL，用乙腈稀释成1 μg/mL的混合标准中间液，再取混合标准中间液用乙腈稀释成100 ng/mL的混合标准工作液，4 ℃保存。(3)内标储备液(1 mg/mL)。分别精确称取孔雀石绿、隐形孔雀石绿同位素内标标准品d5-MG、d6-LMG、d5-CV、d6- LCV 10 mg(精确到0.01 mg)于4个10 mL棕色容量瓶中，分别用乙腈定容至刻度，-18 ℃保存。(4)混合内标工作液(1 ng/mL)。分别准确移取1 mg/mL 的上述4种内标储备溶液0.1 mL，用乙腈稀释成100 ng/mL的混合内标中间液，再取混合内标中间液用乙腈稀释成1 ng/mL的混合内标工作液，4 ℃保存。(5)标准系列溶液。分别取100 ng/mL 的混合标准工作液0.1，0.5，1，2，5，10 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈水溶液(V(乙腈)∶V(水)=50∶50)定容至刻度，得到质量浓度依次为1，5，10，20，50，100 ng/mL的标准系列溶液。

注：*为定量离子对。

Note:* means quantifier transition.

1.5 标准曲线及最低检出限

采用内标法进行定量，由标准储备液配制质量浓度为1，5，10，20，50，100 ng/mL的标准系列溶液，在空白鱼肉样品中添加MG、LMG、CV、LCV标准系列溶液，分别取10 μL上机测定，进行UPLC-MS/ MS分析，以分析物质量浓度与内标物质量浓度的比值为横坐标(X)，以分析物峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。分别按信噪比大于3和信噪比大于10计算本方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.6 加标回收率和精密度分析

以3组阴性样品为测试样品，将MG、LMG、CV、LCV的添加质量浓度均设为50，100和200 ng/mL 3个水平，每个添加水平在相同的试验条件下做6个平行样，对照标准工作曲线计算每个样品的质量浓度，并计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.7 样品测定

在优化的试验条件下，对120份经过前处理的实际样品进行UPLC-MS/MS上机测定，对4种兽药的检测结果进行定量，上样量为10 μL。

1.8 待测物含量的计算

样品中待测物含量的计算公式为：

式中:W样为样品中待测物的含量，μg/kg；C为测定液中待测物的质量浓度，ng/mL；m为样品质量，g；V0为样品定容体积，mL；V1为提取液总体积，mL；V2为过柱总体积，mL。

1.9 检测结果判定及分析

根据检测的结果分别对所有水产品中4种兽药残留的总检出率、16种样品中兽药残留的检出率、10个地市兽药残留的检出率、4种兽药残留的平均水平及同一样品中的兽药混配使用情况进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及最低检出限

MG、LMG、CV和LCV 4种待测兽药UPLC-MS/MS分析结果的线性回归方程、相关系数和线性区间如表3所示。表3显示，MG、LMG在质量浓度为1～50 ng/mL时呈现良好的线性关系，CV、LCV在质量浓度为1～100 ng/mL时呈现良好的线性关系。4种物质的检出限为0.05 μg/kg，定量限为0.15 μg/kg，表明本分析方法具有良好的线性关系，线性范围宽，灵敏度高。

2.2 加标回收率和精密度

以阴性样品为测试样品，在阴性样品中分别加入50，100，200 ng/mL共3个水平的MG、LMG、CV、LCV，并进行上机测定，计算的加标回收率和相对标准偏差如表4所示。表4表明,加标回收率为87.8%～110.8%，相对标准偏差为1.98%～4.32%。

2.3 水产品中4种兽药残留的检测

表5显示，120份鱼肉样品中MG、LMG、CV、LCV 4种兽药的总检出率为4.6%，MG、LMG、CV的检出率分别为1.7%，6.7%，10.0%，未检出LCV，其中CV的检出率最高。

2.4 16种水产品中兽药残留的分析

表6表明，16种水产样品中，MG、LMG、CV、LCV 4种兽药残留的样品检出率为15.8%。其中梭边鱼、鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼、草鱼等5种样品中均有兽药残留检出，其检出率分别为100.0%，100.0%，33.3%，15.4%和11.8%。在13份鲶鱼样品中共检出了3种兽药，33份鲤鱼样品共检出了2种兽药，草鱼、梭边鱼、鲑鱼分别只检出1种兽药。其余11种鱼种未检出兽药残留。

2.5 10地市水产品中兽药残留的分析

由表7可以看出，10个采样地市中，除了榆林以外，其他9个地市鱼样中均检出MG、LMG、CV、LCV残留，商洛、咸阳、铜川、安康、延安、渭南、宝鸡、汉中、西安的检出率分别为10.4%，10.4%，6.3%，6.3%，4.2%，2.1%，2.1%，2.1%和2.1%。其中商洛检出了3种药物，检出率最高为10.4%；而咸阳的12份样品只检出了1种药物，但检出份数是5份，与商洛的检出率相同，均高达10.4%；渭南、宝鸡、汉中、西安均只有1份样品检出药物，检出率均为2.1%。

2.6 水产品中4种兽药残留的平均水平

由表8可知，在检出药物的梭边鱼、鲑鱼、鲶鱼、鲤鱼、草鱼5种样品中，仅有的1份梭边鱼样品检出了CV残留，CV的质量浓度为1.89 μg/kg；仅有的1份鲑鱼样品检出LMG残留，且其质量浓度较高，为2.93 μg/kg；13份鲶鱼样品中MG、LMG、CV均有检出，平均质量浓度分别为0.34，2.13，1.86 μg/kg；33份鲤鱼样品检出了LMG、CV，平均质量浓度分别为1.16，0.46 μg/kg；34份草鱼样品只检出CV，平均质量浓度为0.15 μg/kg。

2.7 同一样品中兽药混配的分析

表9显示，在检出兽药的梭边鱼、鲑鱼、鲶鱼、鲤鱼、草鱼5种样品中，并未在1份样品中同时检出4种药物成分，在梭边鱼、鲑鱼、鲤鱼、草鱼样品中各检出1种药物，但在鲶鱼样品中同时检出多种药物，13份鲶鱼样品中，有1份同时检出了MG、LMG、CV 3种药物，另1份同时检出了MG、LMG 2种药物，这2份样品均来自商洛市，说明商洛市在鲶鱼养殖或运输过程中存在兽药混配使用现象。

3 讨 论

3.1 MG、LMG、CV、LCV的检测方法

目前，用于MG和CV的检测方法主要有液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[22-27]。本研究参照GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》、SC/T 3021-2004《水产品中孔雀石绿残留量的测定:液相色谱法》对检测方法进行了优化[28-29]，采用高效的UPLC-MS/MS法成功完成了水产品中兽药MG、CV及其代谢物残留的检测。

由于MG和CV在水产品中主要以隐性代谢物LMG和LCV的形式存在，具有很好的亲脂性，而且水产品基质化学成分复杂，脂肪含量较高，不利于目标分析物的提取和净化。在样品的前处理过程中，本研究利用中性氧化铝固相萃取净化，去除酸性杂质，消除了油脂和基质的影响，有效保护了色谱柱和质谱仪，提高了检测方法的灵敏度。同时，本研究采用内标定量法配制系列标准溶液，制作标准曲线，且曲线具有良好的线性关系，在信噪比>3时的检测限达到0.05 μg/kg，优于欧盟2004年(2004/25/EC)提出的检测限要求(2 ng/g)；阴性样品加标回收试验表明，平均加标回收率为87.8%～110.8%，相对标准偏差均小于4.32%，达到了较好的准确度及精密度，可以实现良好的质量控制。

在传统的检测方法中，为了能同时检测显色母体和隐性代谢物，通常在液相色谱分离后，利用氧化铅进行柱后衍生，将隐性代谢物LMG、LCV转化为在可见光波长下有强吸收性的显色母体MG和CV[17,30]。但是衍生柱填料的配比容易受到流动相和样品基质的影响，衍生柱的寿命也会影响检测效果，进而影响检测结果的准确性。本研究未使用氧化铅柱，避免了衍生柱质量不稳定对检测结果的影响。

3.2 陕西省水产品兽药残留现状评估

本次抽检结果显示，来自陕西省10个地市的16个品种120份鱼样中，4种兽药的总检出率为 4.6%，MG、LMG、CV的检出率分别为1.7%，6.7%和10.0%，LCV未检出。120份鱼肉样品中有19份样品检出了兽药残留，样品检出率为15.8%，高于2011年农业部有关全国水产品质量安全的例行监测结果(平均检出率9.0%)[31]，16个品种鱼样中有5种(梭边鱼、鲑鱼、鲤鱼、鲶鱼、草鱼)鱼样检出兽药残留。分析认为，导致检出率较高的原因主要是梭边鱼和鲑鱼样品采样量各1份，其中分别检出了CV和LMG，检出率均为100%，但并不能简单地认为梭边鱼和鲑鱼安全性低；相应地，鲤鱼、鲶鱼、草鱼的采样量较多，虽其检出率较低，但也不可认为鲤鱼、鲶鱼、草鱼的安全性较高。其余11种鱼样未检出兽药残留，可能是由于部分鱼种价格贵、数量少、销量小，且多由外省运购，且采样份数少，因此需要加大检测频率和样本量。

本次检测中，MG的检出率为1.7%，LMG的检出率为6.7%，均低于2007年王丽玲等[11]报道的珠海市餐厅池养水产品中MG残留的调查结果(10.2%)，也低于2013年傅武胜等[31]报道的广东、福建水产品中MG的检测结果 (56.1%)。LMG的检出率高于MG，说明多数MG在生物体内转化成了LMG，LMG在鱼体内的清除速率显著慢于MG。有研究显示，在鲇鱼肌肉中，MG和LMG的半衰期分别是2.8和10 d，在虹鳟鱼肌肉中MG的半衰期是1.5 d，LMG的半衰期在10～40 d；在虹鳟鱼苗中，MG和LMG总的半衰期是13 d[32]。这可能是由于部分鱼类体内脂肪含量较高，与兽药结合紧密，造成鱼体内兽药残留量高，从而导致检出率较高。

本次研究还发现：4种兽药中LCV未检出，可能是由于检测时未使用氧化铅柱后衍生，导致LCV未氧化成在可见光区有特异吸收波长的CV，使其结果呈阴性；也可能是由于CV不是用在鱼类养殖过程而是用在后期的运输过程中，鱼吸收CV后还未来得及转化成LCV就被抽样送检。但4种兽药残留中以CV的检出率最高，说明CV在当地存在较为普遍的非法使用现象。

本次研究发现，所采集的16种鱼类中有5种鱼类检出兽药残留(31.3%,5/16)，其中检出MG的有1种(6.3%,1/16)，检出LMG的有3种(18.8%,3/16)，检出CV的有4种(25.0%,4/16)，低于2011年华永有等[14]报道的福建市售淡水鱼中检出MG的鱼种比例53.5%(15/28)，也低于2011年邵生文等[15]报道的湖北省淡水鱼中检出MG的鱼种比例57.1%(8/14)。10个地市中有9个地市的市售鱼样中检出兽药残留，说明陕西省市售水产品中非法使用4种兽药的现象较为普遍，其中咸阳、商洛检出率最高，而且商洛还存在4种兽药混配使用的现象。

综上所述，陕西省水产品中兽药总检出率总体并不高，但在鲤鱼、鲶鱼、草鱼样品中检出率相对较高，且在多个地区样品中均检出兽药，还有多种兽药混配使用的情况，存在MG和CV残留的安全隐患，应当引起食药监部门的相对重视。

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Determination of malachite green and crystal violet residues in aquatic products of Shaanxi in 2013

ZHANG Yi-bei1,YUE Tian-li1,QIAO Hai-ou2,JIA Ru1,JIANG Xu-peng1,LI Lu1

(1CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2ShaanxiProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Xi’an,Shaanxi710054,China)

【Objective】 This study determined residual levels of 4 veterinary drugs in aquatic products in Shaanxi in 2013 to ensure food security.【Method】 A total of 120 fish samples for 16 types were collected from wholesale markets in 10 cities of Shaanxi Province.After homogenate was collected,the veterinary drugs were extracted by acetonitrile and cleaned up by neutral alumina.The concentrations of total malachite green and crystal violet and their metabolites residues were detected by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) and qualitatively and quantitatively analyzed.The total detection rates of 4 veterinary drugs,detection rates of 16 samples,detection rates of samples in 10 cities,mean levels of veterinary drugs residues and the detection rates of mixed veterinary drugs were counted.【Result】 The total detection rate of 4 veterinary drugs was 4.6% and leuco crystal violet was not detected.The detection rate in 16 kinds of samples was 15.8%,and those of spindle edge fish,trout,carp,catfish,and grass carp samples were 100.0%,100.0%,33.3%,15.4%,and 11.8%,respectively,higher than the mean level in China (9.0%).None of veterinary drugs was detected in other 11 kinds of samples.Veterinary drugs were detected in 9 areas except Yulin,with the highest detection rates of 10.4% in Shangluo and Xianyang.Various veterinary drugs were detected simultaneously in the samples from Shangluo,indicating abuse of mixed veterinary drugs.【Conclusion】 The detection rates of 4 veterinary drugs residue in aquatic products were not high in Shaanxi Province.However,the high presence of drugs in carp,catfish,and grass carp samples in 9 areas and mixed abuse of veterinary drugs poses potential threat to human health, which high attention should be paid to.

aquatic products;malachite green;crystal violet;veterinary drugs residues determination;Shaanxi province

2013-12-13

西北农林科技大学“2013年度国家大学生创新创业训练计划”校级重点项目(1201310712174)

张艺蓓(1993-)，女，陕西西安人，本科在读，主要从事食品安全研究。E-mail：zhangyibei0666@163.com

岳田利(1965-)，男，陕西宝鸡人，教授，博士，博士生导师，主要从事食品与发酵工程及食品安全控制技术研究。 E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.012

TS207.3

A

1671-9387(2015)05-0192-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.012.html