模式生物斑马鱼在帕金森病研究中的应用＊

杜雨晨，李淑蓉，苏炳银△

1.成都医学院 发育与再生四川省重点实验室（成都 610500）；2.成都医学院 人体解剖与组织胚胎学教研室（成都 610500）

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是一种影响运动能力的退行性神经系统疾病，一般认为与黑质纹状体的多巴胺能（dopaminergic，DA）通路破坏有关。中脑黑质DA神经元大量死亡可导致DA减少，不能正常传递运动信号，乙酰胆碱功能也相对增强，导致PD患者出现静止性震颤和肌肉僵直等典型的运动症状。

斑马鱼（Daniorerio）由于体积小、胚胎和早期幼鱼透明、神经系统在胚胎发育4d时就已发育成熟，在胚胎时期就能观察到完整的中枢神经系统（central nervous system，CNS）。已经有大量的实验方法包括遗传筛查、实验性操作 Morpholino、药理学实验和转基因荧光靶基因分析等用于斑马鱼的研究，揭示了斑马鱼DA神经系统与其他器官系统发育相比表现出的更多特异性。斑马鱼胚胎透明，能观察到DA长投射纤维在脑和脊髓的分布，对PD的发病机制研究有重要作用。因此，斑马鱼是一种研究PD的良好模式生物。

1 DA神经系统的发育

1.1 DA神经系统的解剖定位

在哺乳动物模型中，DA神经系统主要集中在中脑黑质和腹侧被盖区，即中脑纹状体、中脑缘和中皮质区。因此，了解DA神经系统的发育、进化和演变过程，有助于更准确分析脊椎动物模型DA神经元 及 其 轴 突 投 射［1］。 酪 氨 酸 羟 化 酶（tyrosine hyolroxylase，TH）是DA第一步生物合成的限速酶，目前是被用作动物模型中观察DA和去甲肾上腺素能（noradrenergic，NA）神经元的标志性物质。

Rink Wullimann以及Kaslin、Panula研究小组分别用TH免疫组化法分析了DA神经元在斑马鱼成鱼脑片中的分布及投射情况，结果显示，除去中脑部分，每一张脑片都显示TH免疫反应（THir）阳性。而对反映NA神经元分布的多巴胺β羟化酶（dopamine beta hydroxylase，DBH）的检测则证明了NA神经元只在后脑表达。因此，在斑马鱼前脑发现的THir神经细胞被认定是DA神经元。在端脑，DA神经元可以在嗅球（olfactory bulb，OB），间脑腹侧背侧核、中缝核、腹侧核区域检测到（VdVcVv）［2－3］。在间脑，DA 神经元分布在视前区室旁核前端和后端（PPa，PPp）。同时Chen等［4］和Filippi等［5］两个研究组的研究结果一致表明，不管幼鱼还是成鱼，Th2基因只限于间脑表达，从而明确了斑马鱼中无中脑DA神经系统。

1.2 DA神经系统的发育

用斑马鱼模型来研究DA神经元发育的遗传机制主要有两大优点：1）哺乳动物和硬骨鱼之间进化差别极大，有助于确定在脊椎动物进化过程中调节DA细胞分化的调节分子；2）斑马鱼是优化的脊椎动物模型，对于早期遗传筛选调控DA神经元分化中的特定基因提供了条件。

用BrdU（5－bromo－2－deoxyuridine）或者 EdU（5－ethynyl－2－deoxyuridine）与 TH 免疫组化共定位可确定斑马鱼DA神经系统发育中每个细胞周期开始的时间［7－8］。最早发育的DA前体细胞是发育16h之前有丝分裂后期的DC2DA神经元群落和已发育为蓝斑（locus coeruleus，LC）的NA神经元，证实了这些神经元直接来源于神经板细胞，同样是在16h之前最早开始分裂的DC1和DC4／5前体细胞，却在24h后才开始发育；其他DA和NA神经元，包括端脑、DC3／6／7、Pr和PO并非一直在一个发育周期内持续发育，视网膜DA神经细胞是在有丝分裂后36～42h发育。研究［8］表明，尽管DA神经元发育形成的时间窗较宽，Delta／Notch信号通路诱导的神经发生参与了所有DA神经群的发育形成。

1.3 DA神经元分化形成的分子机制

研究调控斑马鱼DA神经元发育的信号分子和转录因子在DA神经元形成发育中的表达，有助于进一步深入研究DA神经元发育的分子机制。目前已了解到的特异性调控DA神经元分化的特异因子，包括 Th基因［14］和 Otp基因［15］；TGF和 Wnt信号途径调控斑马鱼DA、nr4a2a和nr4a2b同系基因以及锌指蛋白Fezf2／Fezl等。

参与TGF／Nodal信号途径所有基因的突变（cyc／ndr2，oepandsur／oxH1／fast1）都会引起某些DA神经元群落明显减少，特别是间脑腹侧DA神经元，有研究表明Nodal信号是早期胚胎腹侧细胞群发育所必需的。现已明确，Wnt信号通路是DA神经元发育的经典途径［4］。Wnt信号通路拮抗剂dkk1过表达会导致间脑腹侧DA神经元数量增加，可能是通过Wnt8b／Lef1信号通路介导的。其他邻近DA神经元细胞在dkk1过表达后数量并没有发生变化。然而，dkk1只在斑马鱼发育早期（原肠胚时期）增加DA细胞数量，表明Wnt信号途径能够选择性抑制DA前体细胞发育。

由于斑马鱼nr4a2a和nr4a2b基因同系，所以并不能在后结节／下丘脑DA神经元共表达，但能在视前叶、前顶盖和视网膜细胞中表达。有研究［9］报道，敲降nr4a2基因会导致其调控的DA神经元丢失。此外，通过遗传筛选可以筛选出影响DA神经元发育的突变等位基因［6，12］，如斑马鱼胚胎前脑锌指蛋白 Fezf2／Fezl，其同源结构域转录因子Orthopedia（Otp）［10］和PAS结构蛋白 Arnt2［11］。

Fezf2／Fezl从原肠胚开始就在潜在原肠胚区域特异表达，并且为DA神经元DC2－6发育所必需，实验表明Fezf2／Fezl缺失小鼠其他部位的DA神经元发育正常，然而这些 Fezf2／Fezl（－／－）小鼠形成间脑DA神经元亚群时却发育异常。Fezf2／Fezl还能调节DA前体细胞内加工蛋白螺旋折叠因子ngn1，将ngn1敲降后会导致前脑DA神经元减少。另外，Otp选择性表达在后结节、下丘脑DA群DC2和DC4－6［10，12－13］。

1.4 DA神经元投射的形成

DA神经系统轴突生成一般在斑马鱼发育早期阶段1～3d［16－17］。最早出现在 THir DA 神经元间脑腹侧，发育时间是16～24h。首先出现的THir神经元轴突沿着中线生长到达脊髓，这些轴突投射很长从而组成大量中间纵向神经束（mlct）［18］。发育2d，通过免疫组化方法在斑马鱼后脑可检测到THir轴突，发育3d后，更多DA神经束可被识别，发育4d的斑马鱼DA神经元以及轴突投射已经全部长出［6］。现已证实，下丘脑神经束连接后结节和下丘脑；下丘脑－垂体投射以及视前区下丘脑神经束连接视前区和腹侧间脑；前部的神经束连接视前区腹侧间脑与腹侧端脑。进一步，THir神经纤维连接背侧前顶盖和腹侧间脑。

在DA神经元中，依赖Otp的DA神经元十分突出。Otp依赖的DC2和DC4神经元是此时期（4df）投射到下皮层DA神经纤维的唯一来源。其他此类DA神经元向上投射到CNS其他靶点区域，主要包括下丘脑、顶盖、后脑和脊柱。DC5神经元主要投射到脊柱，DC6投射到下丘脑和后脑。依赖Otp的DA神经元也是投射到后脑的DA神经纤维的主要来源。然而，根据遗传分析［18］表明，依赖Otp的A11型DA神经元是斑马鱼幼鱼时期DA长投射的主要来源。

明确DA神经元投射对于研究斑马鱼行为学有重要作用，例如进攻、成瘾、控制某些自主行为等。与四足动物相似，DA可以调节突触前抑制，甚至内源性DA神经元可能瞬时抑制控制幼鱼游泳行为的神经传导［19，21］。但目前对于神经毒素是否可引起斑马鱼运动行为障碍［16］，以及其神经投射和作用机制尚不清楚。

2 转基因斑马鱼模型的建立及其在PD研究中的应用

随着斑马鱼实验方法的不断发展，斑马鱼作为一种研究脊椎动物发育的模型已越来越成熟。在斑马鱼模型上，可以用相对简单的技术实施外源基因的转基因表达和实验性敲降。以往的研究证明，利用转基因操作技术致基因突变可模拟tau蛋白病、多聚谷氨酰胺病以及运动神经元疾病［如肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）］等。斑马鱼繁殖规律，可产生大量后代并且可以进行大规模的遗传和化学筛选。因此，斑马鱼可大批量饲养且养殖便利，在大规模遗传筛选和胚胎发生的分子水平研究中具有独特优势。

2.1 斑马鱼PD模型的建立

斑马鱼端脑区被认为与人类基底节同源，并且与运动神经元退化有关，这个结论已经通过基因表达、神经化学和轴突投射等方法研究证实［3］。背侧和端脑腹侧区来源于胚胎下皮层，被认为是斑马鱼与哺乳动物同源的纹状体。端脑腹侧区含有gama氨基丁酸能神经元、神经内分泌细胞，可分泌P物质、脑啡肽、D1和D2DA受体。新近研究表明，利用96孔板饲养斑马鱼并自动筛选，使其成为目前脊椎动物中进行体内高通量化学筛选的唯一适合模型。

在已构建好的转基因斑马鱼模型的基础上，进一步扩展研究人神经退行性疾病的发病机制，寻找对目前致命的神经系统疾病的有效疗法。

与哺乳动物的情况相似，由DA神经元特异性毒素MPP＋引起的DA系统的损伤可导致斑马鱼幼鱼自主运动异常，使成鱼游泳速度减慢、转弯行为增多等［17］。有趣的是，DA可能在胚胎发育阶段就可以调控运动行为，胚胎发育3d时，前脑DA释放可抑制游泳行为，但在第5天这种抑制作用会衰退［20］。这种相反效应机制目前尚不清楚，然而可利用转基因动物模型研究ALS。

除去DA神经元展示出与人神经退行性疾病相似的神经化学特性和联系性，胶质细胞，包括少突胶质细胞［22］、星形胶质细胞、小胶质细胞［23］也与 PD的发病机制有紧密联系。与哺乳动物的显著区别是斑马鱼的CNS会一直持续生长，并且一生中不断有新的神经元加入。CNS神经纤维损伤后有很强的再生能力，胶质细胞可促进轴突生长，与哺乳动物CNS抑制轴突再生相反。斑马鱼强大的神经生长和再生能力在某种程度上成为了斑马鱼模型的一个缺点，在用其构建神经退行性疾病模型时增加了难度。

2.2 PD致病基因在斑马鱼中的研究

斑马鱼与其他脊椎动物有很大的遗传相似性。很多已报道过的可引起遗传性神经变性的疾病与斑马鱼有高度的同源性，可引起相应神经元功能减退或死亡，从而支持了斑马鱼在研究基因功能和发病机制方面是一个合适的模型——在斑马鱼体内可找到某些人直系同源基因［4］，包括PD、阿尔兹海默病和亨廷顿舞蹈病中的基因。

目前有3个公认的可引起常染色体隐性疾病的病因：1）PRKN基因在6号染色体短臂上（PARK2）编码Parkin，是一种E3泛素连接酶，对调节线粒体功能起到重要作用［24］；2）DJ－1基因在1号线粒体长臂上（PARK7）编码一种未知蛋白，可在某种过氧化条件下迁移至线粒体；3）Pink1基因，同样定位在1号染色体长臂上（PARK6）编码磷酸酶和Pink1，与调节线粒体功能有关［25］，与Parkin基因有共同的调控途径。除去PARK－2介导的青少年PD，临床上由这些基因突变引起的PD十分少见。然而，它们对于理解自发性PD的发病机制十分重要。

斑马鱼在胚胎发育时期瞬时敲降Parkin、DJ－1和Pink1基因，通过验证发现，化学修饰的吗啉反义寡核苷酸（Morpholino）法可以针对某段特定的mRNA靶序列设计一段序列来阻碍mRNA前体剪接，通过与翻译起始编码区互补序列或剪接信号方法完成。Morpholino在体内非常稳定，通过显微注射法使其扩散至整个胚胎，可逐步抑制基因表达。斑马鱼和人类DJ－1基因83%的氨基酸是一致的。DJ－1在斑马鱼脑和肠中有大量表达［25］，在CNS内，DJ－1在脑和脊髓表达，包括在DA神经元内表达［26］。用Morpholino反义寡核苷酸法显微注射敲降DJ－1转录子后，DA系统在斑马鱼胚胎中可正常发育形成，然而DJ－1敲降会导致DA神经元氧化应激敏感性增强［27］。有趣的是，斑马鱼胚胎经受了DJ－1敲降后也表现出对蛋白酶抑制剂极强的敏感性，证明DJ－1功能和神经元蛋白降解之间存在一定联系［27］，这是自发性PD的潜在发病机制。缺失DJ－1会引起p53基本水平升高，同时敲降DJ－1和p53抑制分子mdm2可引起DA细胞的死亡［27］。培养哺乳动物DA细胞，DJ－1被证明是p53的转录抑制剂［28］。与哺乳动物中CNS情况相似，斑马鱼DJ－1在氧化应激条件下是上调的［29］。

斑马鱼Parkin基因氨基酸序列与人类的相似度为62%［30］。Parkin基因从斑马鱼早期胚胎发育到成鱼一直表达，在斑马鱼发育3d后，Morpholino沉默Parkin基因导致了间脑DA神经元数量减少，并且增强了其对DA神经毒素MPP＋的敏感性［30］，这可能是一个重要发现。Parkin基因缺失导致DA神经元数量减少，这与人PARK2相关PD很相似，但到底是瞬时的发育迟滞，持续的发育异常，还是真正的神经退行性变，目前还不清楚。Parkin敲降后在发育5d时对游泳行为没有影响［30］。此外，Parkin基因敲除后会导致线粒体复合体I的数量减少，从带有突变Parkin基因的患者身上提取的纤维母细胞也被观察到有异常表型。Parkin的缺失可促使斑马鱼体内产生某些生化和病理变化，并与人类身上Parkin基因突变产生的效应相似。

斑马鱼Pink1与人类Pink1基因54%同源，从发育早期就开始表达［31］。在成鱼脑中，Pink1在视旁核核间脑DA神经元富集［31］。Pink1敲降48h后神经元TH表达降低，导致严重发育缺陷，如脊柱弯曲、尾部发育缺陷，脑顶盖及合缝形成受损等。一些异常发育在野生型斑马鱼中可逐渐恢复，但这种发育缺陷不是因为Pink1突变（人体内是过表达）造成的。氧自由基产生增多，被认为是人PD的主要发病机制，敲降Pink1引起氧自由基增多。Pink1的突变表型与wnt突变导致的GSK3b通路激活效应类似。由于GSK3b的抑制剂可以使部分突变表型恢复，所以AKT－GSK3b通路异常可能与Pink1缺失效应相关，GSK3b功能的研究目前在哺乳动物Pink1模型中未见报道，因而在Pink1发病机制的研究中还没有新发现。

总的来说，采用斑马鱼模型作为动物模型进行PD研究涉及人退行性疾病的大脑核心区域的结构和功能、细胞类型，基因、蛋白和信号通路等多方面。通过斑马鱼模型的建立，能够更深入地研究人类PD的发病机制，获得更多有效信息。

2.3 斑马鱼模型研究PD的局限性

现阶段分子生物学技术已经广泛应用于斑马鱼研究，但仍存在一些问题。首先，目前人类隐性遗传神经退行性疾病的斑马鱼模型是在胚胎中通过Morpholino瞬时敲降来建立的，而成鱼的PD模型建立方法尚不清楚。斑马鱼种系的无效等位基因（null alleles）目前不能通过小鼠研究中类似的技术手段获得，从而使得通过高通量在突变基因中筛选稳定突变的方法很有必要。利用锌指核酸酶技术可将靶向等位基因导入感兴趣基因［3］，造成稳定突变，会提高斑马鱼模型的研究价值［5］。因此，在斑马鱼中研究神经退行性疾病的隐性表型时，这种方法比瞬时敲降更可靠。其次，斑马鱼目前还未建立良好的行为学模型，这在一定程度上阻碍了形态学、组织学和基因学的研究进展。虽然现在有关行为学的实验结果都有效，但是并没有充分利用在体模型这个优点。斑马鱼神经功能障碍发生在细胞死亡之前，可以明确某种神经保护药物治疗的靶向性，动物疾病模型对于药物的开发有重要的意义。

3 总结与展望

利用斑马鱼模型从发育、细胞和行为学分析有助于更好地理解DA神经元投射和脊椎动物的进化过程。尽管斑马鱼作为一种较为低级的脊椎动物，其CNS和人类CNS存在显著的差异，但构成CNS的基本结构神经元和神经胶质细胞有许多相似之处。在PD的研究中，斑马鱼内生性DA神经元在下皮层、纹状体的功能研究引起了研究者的关注。灵长类动物DA神经元投射到纹状体，现在有待研究的是斑马鱼下皮层是否是DA神经元主要投射部位，以及它们的缺失能否引发与哺乳动物黑质纹状体破坏后相似的行为学表现。

很多研究证明，PD的发病机制与蛋白功能的丢失或是过表达有关，进而可影响哺乳动物的DA神经元。在调控DA神经元分化的信号途径方面，依赖Otp的DA神经元明显投射到下皮层，这与哺乳动物A11DA神经元相似。A11系统的功能主要有：1）发育过程依赖Otp特定分化为A11型DA神经元以及一些神经内分泌神经元，包括CRH神经元［25－26］，与神经内分泌系统紧密联系；2）依赖 Otp的DA神经元和CRH神经内分泌神经元的下行间脑脊髓投射可能一致，这些与躯体运动功能有关。这个发现引起了假设，依赖Otp的DA可能与基本运动模式有关，例如在主动活动和被动应对之间转换［32－33］。而 A11系统一直与运动疾病有关，例如Ekbom综合征、不宁腿综合征［32－33］。A11系统对DA神经退行性疾病的影响仍需深入研究。

利用转基因斑马鱼模型研究疾病的发病机制有巨大潜力，但还存在许多问题。一些早期研究的阳性结果在人类疾病方面还不具有完全代表性，例如斑马鱼幼鱼模型的形态异常以及功能紊乱不能完全反映人类临床疾病，根据斑马鱼脑的发育速度能看到短暂的发病过程，然而利用斑马鱼模型研究人类慢性进行性疾病发病机制只能压缩病程。总之，这对更好地理解真正的疾病和疾病动物模型之间的差别也是极为必要的一种方式。

最新研究［34］表明，人构建致病突变基因导致的斑马鱼神经系统异常可以被检测和定量分析。在构建转基因斑马鱼模型的基础上有待进一步构建稳定遗传系的基因表型，选择最具有疾病代表性和最适合高通量筛选的模型。优化模型和实验结果对今后筛选有价值的实验结果很重要，对神经科学的发展意义重大。

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