超高效液相色谱-质谱联用技术在药代动力学研究中的应用*

杜闻杉，刘 沛，刘翠哲

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北　承德　067000）

综述讲座

超高效液相色谱-质谱联用技术在药代动力学研究中的应用*

杜闻杉，刘 沛，刘翠哲△

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德067000）

UPLC-MS/MS；HPLC-MS/MS；药物代谢动力学

超高效液相色谱是一种柱效高、发展前景好的液相色谱技术，与HPLC相比，具有鉴别能力强、灵敏度高、分离度好等诸多优势。本文查阅近年来的相关文献资料，对超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/ MS）的发展状况及近年来该技术在药代动力学方面的应用作一综述。

1　UPLC-MS/MS的原理与特点

超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）技术是应小粒径填料（粒径＜2μm）和超高压（压力＞105kPa）要求而专门设计的，其保持了传统高效液相色谱（HPLC）系统的基本原理，但其分离效能和分离速度得到极大提高，能明显改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，尤其与质谱联用更能显示其卓越的性能。液质联用（LC-MS/MS）分析技术的发展，为药物体内代谢产物的分析鉴别提供了简便、快速的分析方法［1］，推动了药物代谢动力学的新发展。

UPLC保持了HPLC的基本原理，其理论依据于范迪姆特（Van Deemter）经验方程。在HETP=Adp+B/v+C（dp）2v式中，HETP为理论塔板高度，A为涡流扩散系数，dp为填料粒径，B为分子径向扩散系数，C为传质因子，v为流动相线速度。由该方程可以得出结论：降低颗粒度不仅提高柱效，同时也提高速度。随色谱柱中装填固定相粒度dp的减小，色谱柱的理论塔板高度H也越小，色谱柱的柱效越高，并可获得更宽的线速度范围，达到分离分析的高速、高效和高灵敏度。UPLC采用了1.7μm颗粒度的色谱柱填料，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，弥补传统HPLC的不足。

2　UPLC-MS/MS在药代动力学研究中的应用

药代动力学是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律的一门学科，同时已拓展到药物体内整个处置过程（ADME）的机制性研究、复杂药物体系的相互作用及药物作用物质基础的动态研究等方面。UPLCMS与HPLC-MS相比，分析方法更加灵敏，在化药药代动力学的研究中优势明显，同时，其强大的分离分析能力适用于具有复杂性的中药组成成分和具有复杂化合物体系的体内代谢，UPLC-MS在药代动力学研究中的表现极其优越 ，从诞生到现在已经取得了不少成果。

2.1西药药代动力学的研究Johnson［2］用UPLC-MS法检测健康志愿者口服扑热息痛片（对乙酰氨基酚）后尿液中的代谢物，其谱图的平均基线峰宽为3s，窄于HPLC的4.8s，而峰高却是后者的3倍，可以检测到3个S-半胱氨酸结合物，其中一个为使用HPLC-MS未曾发现的。另外，通过与HPLC-MS分析对比发现，UPLC灵敏度大约是常规HPLC分析方法的3倍，并在单位时间内可以检测到更多的代谢产物［3］。王文辉等［4］采用UPLC-MS/MS方法，电喷雾质谱正离子模式电离，结果显示：环磷酰胺在2-100ng/ml的浓度范围内呈良好的线性关系，检出限为1μg/ml，运行时间仅为4min；而使用HPLC和HPLC-MS测人体血浆中环磷酰胺的含量，结果显示：环磷酰胺线性范围分别为0.001-0.200mg/ml 、0.026-1.08mg/ml，最低检出量分别为0.25 mg/ml、10μg/ml，运行时间超过10min［5］。沈国荣等［6］使用UPLC-MS法测定人血浆中阿奇霉素的浓度，正离子多离子反应监测（MRM）扫描分析，结果显示阿奇霉素血 药浓度线性范围为2-1000ng/ml，定量下限为2 ng/ml，而使用HPLC法［7］和LC-MS法［8］，线性范围分别为5×104-5×106ng/ml、2.5-800ng/ml，最低检测限分别为5ng/ml、2.5ng/ml。胡东莉等［9］建立了用UPLC-MS/MS测定他莫昔芬（TAM）含量及血浆浓度的方法，相比于不能同时测定代谢产物的高效液相色谱紫外法［10］和只能检测到主要代谢产物（如TAM、NDT、4-OHT）的高效液相荧光法，UPLC-MS/MS能够实现同时检测TAM及其多个代谢产物（如4-OH-Tam、4- OHND-Tam、ND-Tam、Tam Nox、Tam-d5）的血浆浓度，样本处理简便，分离度高、重复性好。王伟等［11］采用UPLC-MS/MS法，对卡马西平、拉莫三嗪、氯硝西泮、地西泮及其代谢物奥沙西泮这5种化合物进行血药浓度测定及药动学研究，采用甲醇直接沉降处理血浆，样品处理简单、快速，短时间内可完成一个样品中5种成分的定性定量分析，分离度高。而采用HPLC［12］测定血浆中5种化合物，分离度较低，样本量大；采用 HPLC-MS/MS法［13］，样品预处理多采用液-液萃取或固相萃取法，提取过程复杂、费时。

2.2中药药代动力学的研究在中药和中成药药代动力学研究方面，因为中药和中成药组成成分本身已经具有的巨大复杂性，体内代谢后带来更复杂的化合物体系，UPLC-MS强大的分离分析能力可得到更充分的体现。

2.2.1中药材及提取物的药代动力学研究：刘子修等［14］采用UPLC-MS技术，用蛋白沉淀法［15］去除血浆杂质，测定积雪草苷血浆药物浓度，结果显示：样品在1.4 min出峰，线性范围在0.038-7.6μg/ml，检出限为0.038μg/ml。积雪草苷的吸收波长处于紫外末端，利用紫外检测器（UV）测定时受干扰严重，血浆样品杂质干扰大，易产生误差，结果显示：HPL C-UV线性范围为2.5-40.5μg。利用蒸发光散射检测器（ELSD）测定时，样本量大，结果显示：HPLC-ELSD［16］线性范围为0.35-7.0μg，二者运行时间均超过10min。苏红等［17］采用UPLC-MS-MS分析方法，以多反应监测（MRM）方式进行负离子模式检测，研究大鼠静脉注射赤芍提取物后，其指标性成分没食子酸、芍药苷在大鼠体内的药代动力学，其血浆样品处理采用乙腈沉淀蛋白。结果显示：没食子酸最低检测限为0.11mg/L，仅4min就完成一个样品的分析；而采用传统的HPLCUV［18］，血浆样品中没食子酸血浆样品最低定量限为0.3mg/L，分析时间超过15min。相比于其它方法，UPLCMS技术具有更快的分析速度，其专属性强， 灵敏度高。黄勇等［19］采用UPLC-MS/MS技术，分别对血浆中异荭草素和野黄芩苷进行Beagle犬体内药代动力学［20］研究和Wistar大鼠体内的药动学研究［21］：在Beagle犬血浆中同时测定2种物质和原儿茶酸的含量，使用UPLC大大提高了对复杂生物样品的分离能力，同时，MS/MS 技术将待检测的3种物质与内源性杂质峰完全区分开来；在Wistar大鼠血浆中测定2种物质和木犀草苷的含量，结果显示：3种黄酮成分在大鼠血浆中分离度好，较HPLC显著提高了定性分析的准确性及定量分析的重复性、可靠性。

2.2.2中成药药代动力学的研究：窦志华等［22］利用UPLC-MS/MS方法分别对复方五仁醇胶囊大鼠灌胃后吸收进入血液的木脂素类成分进行分析，标出了10批含药血清色谱图共有13个峰，其中8个为制剂原形成分入血，5个为代谢产物。相比只鉴定出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素4个木脂素类成分的常规HPLC-MS法，采用UPLC-MS/MS进行分析，最终确认了进入血液的5个代谢产物，其中五味子酯甲是原来HPLC-MS法检测未曾发现的。居文政等［23］采用UPLCMS/MS法研究了注射用银黄制剂在健康人体的药动学，同时测定志愿者静脉滴注注射用银黄后黄芩苷和绿原酸的血药浓度。同等条件下，上述药物检测方法同HPLCMS相比较，测定分离度明显好于后者［24］，为临床合理用药和该制剂的内在质量评价提供依据。

3　展望

UPLC是一种较为新颖的技术手段， 在灵敏度、分析速度和分离度等方面优于传统的HPLC。UPLC-MS联用技术将UPLC的高分离性能和MS的高鉴别特点相结合，形成了一个更加完美的现代分析技术，能够充分适应现代药物研究新发展。随着科学技术的不断发展，UPLCMS必将药物研究领域展现更好的应用前景，成为推动其进步的重要动力。

［1］刘亚妮，刘金梅，魏柳珍.LC-MS/MS测定人血浆中辛伐他汀及其活性代谢物的含量［J］.药物分析杂志，2012，32（9）：1612.

［2］Johnson KA， Plumb R.Investigating the human metabolism of acetaminophen using UPLC and exact mass oa-TOF MS［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，39（3-4）：805-810.

［3］吴剑威，赵润怀，陈波，等.超高效液相色谱在中药领域的应用［J］.中草药，2009，40（s1）：79-81.

［4］王文辉，杨俊，陈瑶，等.超高效液相色谱-质谱法测定人体血浆中的环磷酰胺［J］.光谱实验室，2011，28（6）：2888-2890.

［5］黎远冬，张炜炜，梁宁生，等.HPLC法测定人体血浆中异环磷酰胺及环磷酰胺的浓度［J］.广西医科大学学报，2014，31（1）：102-104.

［6］沈国荣，董吉，缪丽燕，等.UPLC-MS法测定人血浆中阿奇霉素的浓度［J］.中国药房，2012，23（18）：1665-1667.

［7］李东，王大果，聂中越，等.HPLC法测定阿奇霉素的血药浓度［J］.中国临床药学杂志，2003，12（16）：355.

［8］王玉花，陈俊杰，陈本美，等.液质联用测定血浆中阿奇霉素及其人体药动学和相对生物利用度研究［J］.中国药学杂志，2006，41（1）：51.

［9］胡东莉，陈尧，沈杰，等.UPLC-MS/MS同时测定血浆样品中他莫昔芬及代谢产物的浓度和应用［J］.中国临床药理学与治疗，2012，17（7）：773-778.

［10］Lajeunesse A，Vernouillet G，Eullaffroy P，et al.Determination of carbamazepine in aquatic organisms by liquid-liquidextraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Environ Monit，2009，11（4）：723-725.

［11］王伟，刘永锁，乔湜，等.UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中卡马西平、拉莫三嗪、氯硝西泮、地西泮及其代谢物奥沙西泮浓度［J］.中国现代应用药学，2013，30（11）：1215-1219.

［12］Hotha KK，Kumar SS，Bharathi DV，et al.Rapid and sensitive LC-MS/MS method for quantifi cation of lamotrigine in human plasma： application to a human pharmacokinetic study［J］.Biomed Chromatogr，2012，26（4）：491-496.

［13］Liu Y，Wang L，He DK.Determination of carbamazepine，lamotrigine，phenobarbital，phenytoin sodium and10，11-epoxycarbamazepine in human serum by high performance liquid chromatography［J］. Chin J Clin Pharmcol Ther，2005，10（8）：846-851.

［14］刘子修，刘史佳，居文政，等.UPLC-MS法测定大鼠血浆中积雪草苷的浓度及其药代动力学研究［J］.中国药理学通报，2010，26（4）：543-545.

［15］Liu SJ，Ju WZ，Liu ZX，et al.Pharmacokinetic study of saikosaponin a in rat plasma by LC-ESE- MS［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（10）：1380-1383.

［16］Rafamantanana MH，Rozet E，Raoelison GE，et al.An improved HPLC-UV method for the simultaneous quantification of triterpenic glycosides and aglycones in leaves of Centella asiatica（L.） Urb （APIACEAE）［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877（23）：2396-2402.

［17］苏红，何峰，刘志宝，等.UPLC-MS-MS法同时检测大鼠血浆中没食子酸和芍药苷的浓度及其药代动力学研究［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（4）：94-98.

［18］刘英慧，陈晓玲，黄琪，等.高效液相色谱法测定檵木叶中没食子酸的含量［J］.中南药学，2012，10（1）：33.

［19］黄勇，何峰，郑林，等.UPLC-MS/MS同时测定Beagle犬血浆中原儿茶酸、异荭草素和野黄芩苷［J］.中国药理学通报，2011，27（5）：716-719.

［20］Wang YC，Liu ZP，Zhang DR，Xu JX.Determ ination of silybin in beagle dog plasma by LC/MS［J］. Chin Pharmacol Bull，2010，26（5）：679-83.

［21］黄勇，何峰，郑林，等.UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中异荭草素、野黄芩苷和木犀草苷及其药代动力学研究［J］.中国中药杂志，2012，37（4）：529-532.

［22］窦志华，丁安伟，居文政，等.复方五仁醇胶囊含药血清中木脂素类成分的UPLC/MS/MS分析［J］.中成药，2007，29（4）：550-555.

［23］居文政，刘芳，吴婷，等.UPLC/MS/MS法同时测定人血浆中黄芩苷和绿原酸［J］.药学学报，2007，42（10）：1074-1077.

［24］黄昆，王文辉，李宝才，等.超高效液相色谱和质谱联用在药物研究领域的应用［J］.光谱实验室，2009，26（4）：924-929.

R969.1

A

1004-6879（2015）05-0425-03

2015-06-26）

* 河北省高校重点学科“中药学”建设项目资助