三相中空纤维微萃取 -高效液相色谱检测尿液中的海洛因代谢物

王 丹孟品佳陈琳琳（中国人民公安大学 北京 00000； 中国刑警学院 辽宁 沈阳 0035）

三相中空纤维微萃取 -高效液相色谱检测尿液中的海洛因代谢物

王 丹1孟品佳1陈琳琳2
（1中国人民公安大学 北京 100000；2 中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035）

建立了中空纤维液 -液 -液三相萃取模式 （3p-HF-LPME） -高效液相色谱 （HPLC）法测定尿中的海洛因代谢物吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因的方法。对高效液相色谱的检测条件及影响液相微萃取的因素进行了考察和优化。

中空纤维 液相微萃取 海洛因代谢物 高效液相色谱

我国的毒品问题依然复杂严峻。海洛因是其中最具代表性的毒品，据2014年《中国禁毒报告》，全国滥用海洛因人员 132.6万名，同比上升 6.6%，占吸毒人员总数的53.6%。[1]海洛因体内代谢的研究一直是分析中的重要内容，对于禁毒工作具有重要意义。对于海洛因吸食者，其代谢物吗啡、O6-单乙酰吗啡以及可待因在检测过程中是非常关键的目标物，但由于此类化合物的极性较大，具有亲水性，很难用气相色谱法直接进行检测，色谱行为较差，检测灵敏度偏低，通常需要进行衍生化处理[2]后用气相色谱法检测或用液相色谱法、毛细管电泳等仪器进行检测。[3]

对于生物检材中的海洛因，其样品前处理方式主要是液相萃取，但液相萃取易于乳化，很难自动化，需要大量的有机溶剂，毒性较大，产生大量实验室废液，污染环境。Pedersen-Bjergaard[4]等人提出的中空纤维液相微萃取技术是将有机溶剂固定在中空纤维孔壁内，生物样品中的大分子杂质难以通过纤维孔进入接收相，中空纤维对样品溶液起到微孔过滤的作用，集萃取、过滤、富集于一体。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

日本日立高效液相色谱仪（HITACHI D-7000；检测器：UV L-7420），HSM色谱工作站，色谱柱phenomenex C18反相色谱柱 （250×4.6mm，pH范围2-10），DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪高科仪器厂），AccurelQ3/2聚丙烯中空纤维（Membrana，Wupperta，Germany，壁厚200μm，孔径0.20μm，内径600μm）。

吗啡盐酸盐、O6-单乙酰吗啡盐酸盐、磷酸可待因标准品均购于公安部物证鉴定中心；甲醇、乙腈均为色谱纯。磷酸、磷酸二氢钾、三乙胺、甲苯、环己烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正辛醇和甲苯均为分析纯；实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 标准溶液配制

标准储备溶液（1.0mg/mL）：用电子天平精密称取盐酸吗啡1.13mg、O6-单乙酰吗啡1.11mg、磷酸可待因 1.11mg分别溶于 lmL甲醇中，配成 1.0mg/mL的甲醇储备液。标准工作液：分别准确量取上述1.0mg/mL的标准储备液各10μL，加入pH2磷酸溶液定容至 1.0mL，配制成10.0μg/ml的混合标准工作液。

1.3 三相中空纤维液相微萃取操作方法

将健康空白尿液或海洛因吸食者尿液用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9，作为本实验的样品相。取10mL放入样品瓶中，加入5×10mm微型磁力搅拌子。

取中空纤维将其剪切为5cm长，将其放入丙酮

中超声5min，消除中空纤维中的可能杂质。将处理过的中空纤维浸入辛醇溶剂中1min，取出，迅速用气相色谱专用微量注射器吸取 20μLPH2磷酸 （接收相）注入中空纤维内腔中，两端用5mL一次性注射针头固定形成U型模式（如图1），插入样品溶液中，将样品瓶瓶盖密封，放入恒温磁力搅拌器中，调节温度 30℃，磁力搅拌转数为 1000r/min，萃取 40min后，停止搅拌，用微量注射器在针头一端抽回内腔中接收相，直接注入到高效液相色谱中检验。

图 1 中空纤维液相微萃取装置

1.4 高效液相色谱检测条件

色谱柱：phenomenex C18柱（250mm×4.6mm，pH范围2-10），流动相条件：流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾+0.02mol/L三乙胺水溶液，用磷酸调pH=6.0；流动相 B∶乙腈，A、B均脱气备用。流动相分配为 A∶B=90∶10。流动相流速为 1.0mL/min，紫外检测波长为210nm，进样量为10μL。

1.5 萃取回收率和富集倍数计算方法

目标分析物的富集倍数（enrichment factor，EF）和回收率 （R） 可依据以下公式计算，

na,final和ns,initial分别是分析 物萃取前在样品 相中和萃取后在接收相中的摩尔浓度，Va为接收相的体积，Vs为样品相的体积，Ca,final为分析物在接收相中的浓度，Ca,initial为分析物在样品相中的最初浓度。

2 结果与讨论

2.1 理论阐述

中空纤维三相微萃取体系包括三相：样品相、有机相（中空纤维内壁）、接收相，将中空纤维插入有机溶剂中，有机溶剂通过毛细力或注入方式进入到中空纤维内膜中，然后将接受相 （水相） 注入中空纤维内腔内。在本研究中，尿中吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因萃取前调至碱性，使吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因呈有机态通过搅拌加速被萃取到有机相中，接收相将pH值调节为酸性，分析物在有机相与接受相界面上与接受相中的酸中和为离解状态，被反萃进入接受相。接受相中的分析物可直接进样到HPLC或CE进行检测。

2.2 中空纤维液相萃取条件的选择与优化

样品相为向健康人尿液中添加三种目标物的标准溶液，定容为10mL，令其中目标物浓度均为10mg/L，按照1.4的高效液相色谱检测条件进行检测。以目标物在萃取中所获得的富集倍数作为其萃取效率的考察指标。

2．2．1 有机溶剂对萃取效果的影响

有机溶剂是影响萃取效果的重要因素。三相中空纤维微萃取对萃取溶剂的要求：一是与中空纤维有很好的兼容性，可以稳定地存在于纤维的内腔或壁孔中不能泄露；二是对目标分析物有合适的溶解度和选择性，不易挥发，毒性小。[5]本实验选择甲苯、正辛醇、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、环己烷 6种有机溶剂作为萃取剂，按照1.3的萃取操作，对含10mg/L的三种目标化合物加标工作溶液进行检测。结果见图2。正辛醇作为有机相时，接收相体积稳定，吗啡、06-单乙酰吗啡、可待因的富集倍数明显高于其它溶剂。苯及其衍生物中仅甲苯对鸦片类毒品有一定萃取，但甲苯作为三相萃取溶剂，随着萃取时间的增加，接收相流失严重。而烷烃类溶剂对3种目标分析物几乎没有萃取。乙酸乙酯对 3种目标化合物有一定的萃取作用，但乙酸乙酯沸点低，接收相也有一定的损失。乙酸丁酯与异丙醇的情况略好一些，对3种目标分析物均有一定的富集效果。我们实验中的3种目标分析物，均具有一定的极性和亲水性，正辛醇中的羟基（-OH）能与吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因结构中（-OH）形成氢键，增加该类化合物在正辛醇中的溶解度。氢键可能是决定萃取效率的主要因素，与吗啡等形成氢键能力越强的有机溶剂萃取效率越高，反之越低。本实验选择所考察溶剂中萃取效率最高的正辛醇作为萃取溶剂。

图 2 有机溶剂对萃取效果的影响

2．2．2 样品相和接收相pH值对萃取效果的影响

在3p-HF-LPME中，调节样品相的pH值，改变目标分析物在样品溶液中的存在形态，使其以化合物原体形态被有机溶剂萃取，而调节接收相的pH值，使分析物呈离解状态，即能使分析物迅速从有机溶剂中反萃出来，又能够防止其重新扩散回有机溶剂中。因此 pH可以改变酸性或碱性目标分析物在样品溶液中存在的形态，从而影响化合物在样品相、有机相与接收相三相之间分配平衡系数，从而影响萃取效率 。[6]

实验中用 0.1mol/LNaOH调节样品相，令其 pH分别为 8、9、10、11、12，按照 1.3的方法操作，接收相为磷酸（pH=2），萃取后，取接收相直接进入HPLC分析。结果如图3所示，吗啡在pH=9时萃取效率最高，之后随着 pH值的增高而下降。O6-单乙酰吗啡与可待因的富集倍数随着pH的增高而增大，当pH为11之后变化不明显。综合考虑，结合吗啡的情况，实验样品相pH选择调节为9。

图3 样品相pH对萃取效果的影响

图 4 接收相对萃取效果的影响

对于3p-HF-LPME，接收相的pH不但要能够使目标分析物呈离解状态，完全从有机溶剂中反萃出来，还能满足后续仪器分析的直接进样的要求。检测碱性化合物常用的酸主要有盐酸、磷酸、甲酸等。本实验中充分考虑到后续用HPLC做为分析仪器时，盐酸中的氯离子对色谱柱的影响很大，能够加速其 C18色谱柱的退化。本实验选择磷酸作为接收相介质。用pH计调节配制不同pH值的磷酸溶液，按照1.3的方法操作，萃取剂为正辛醇，接收相为 pH为 1.0、2.0、3.0的磷酸，萃取后，取接收相直接进入 HPLC分析。结果表明见图4，pH1.0时的富集效率最大，随pH增大，富集效率下降，但综合考虑pH过大对色谱柱造 成 影 响 ， 最 终 选 择 pH2.0的 接 受 相 进 行3p-HF-LPME。

2．2．3 萃取时间对萃取效果的影响

取样品相按1.3的萃取操作,考察萃取时间分别为10、20、30、40、50、60min时对富集效率的影响，结果见图5。结果表明，随着萃取时间的增加，富集倍数增加，这是由萃取平衡决定的，但对于3p-HF-LPME，萃取时间不宜过长，接受相会随着搅拌流失，也会导致其与有机溶剂互溶，富集倍数降低。实验表明萃取 40min可以获得较好的回收率与富集倍数。

图 5 萃取时间对萃取效果的影响

图 6 搅拌速度对萃取效果的影响

2．2．4 搅拌速度对萃取效果的影响

提高搅拌速度可以促进分析物在 3p-HF-LPME之间的传质。本实验按1.3的萃取操作，考察了搅拌速度分别为400、600、800、1000、1200r/min时富集倍数的情况，结果（图6）表明，当转速为1000 r/min时，萃取效果最好。若继续增大转速，可能导致：（1）正辛醇有机膜被破坏，萃取效率降低；（2）尿液可能会发生乳化现象。因此，本试验选择1000 r/min作为搅拌速度。

2.3 优化条件下的加标尿样色谱行为

本实验在优化的液相色谱条件和液-液-液中空纤维萃取条件下，分别直接将空白尿液经过0.45μm滤膜过滤后直接进样分析；空白尿液经过3P-HF-LPME后进样；3种目标分析物的浓度为500μg/L的混合标准溶液直接进样；样品相3个目标分析物的浓度为500μg/L混合标准工作的加标尿样经过 3P-HF-LPME后进入 HPLC进行分析。结果见图7、8、9、10。

图7显示尿样中的组成复杂，干扰物质多，必须经过萃取除去杂质；图8显示空白尿样进行3p-HF-LPME后色谱峰干净，表明尿液中的大分子物质、蛋白质等干扰成分已经被中空纤维膜隔离，没有进入接收相，表明中空纤维膜能有效的阻止复杂样品基质中的干扰物。图9与图10相比，通过液相色谱峰的峰高（H），能够看出，通过 3p-HF-LPME，3个目标分析物的峰高显著增高，说明该萃取模式能够对目标分析物进行显著的富集。结果表明，中空纤维液相微萃取方法具有非常好的净化与富集能力。

图7 空白尿样直接分析色谱图

图8 空白尿样经3p-HF-LPME后色谱图

图9 浓度为500μg/L萃取后的混合标准溶液的加标尿样直接分析色谱图；1-吗啡，2-可待因，3-O6-单乙酰吗啡

图10 目标分析物的浓度为500μg/L经过3p-HF-LPME后色谱图；1-吗啡，2-可待因，3-O6-单乙酰吗啡

2.4 富集倍数与回收率

取预先调好pH为9的健康人尿液，添加混合标准工作液，定容为10mL，分别配制3种目标分析物的浓度分别为 50μg/L、200μg/L、500μg/L的样品相，在优化的高效液相色谱条件与 3p-HF-LPME萃取条件下，按1.3的萃取操作进行，直接进行HPLC分析，每个样品平行萃取5次。目标物的峰高响应值与 50μg/L、200μg/L、500μg/L标准工作溶液的峰高响应值比较，按照1.5的计算公式，得到富集倍数。

在回收率计算中，其中样品相体积Vs固定为10mL，接收相体积按照 1cm内腔为 600μm聚丙烯中空纤维的体积约为2.6μL（一般情况下长度为1cm，壁厚为200μm，内径为600μm，壁孔为0.2μm的中空纤维可固载体积为8μL的有机溶剂，内腔内可容纳 2.6μL的 溶剂[5]）， 则 本 实 验 的 接收 相 体 积 为13μL，样品相体积10mL，按照1.5的计算公式，得到目标分析物的萃取回收率。结果见表1。

表 1 吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因富集倍数与回收率计算结果

2.5 工作曲线制备、检测限、相对标准偏差

向pH为9的尿液中添加混合工作液，稀释配制浓度分别为 10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，500μg/L不同浓度的标准溶液，在优化的萃取条件下，按1.4色谱条件检测，绘制工作曲线，计算相关系数，以3倍信噪比计算最低检测限。检测结果见表2。

表 2 吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因标准工作曲线

2.6 吸毒嫌疑人尿液的检测

在优化的萃取条件和高效液相色谱条件下，取某地的吸食海洛因嫌疑人的送检的尿液进行了萃取和测定，经计算，该嫌疑人尿液中吗啡、O6-单乙酰吗啡及可待因浓度为4.7、3.8、0.23mg/L。检测结果表明该嫌疑人吸食毒品海洛因。

[1]中国国家禁毒委员会，2015年中国禁毒报告，2015年3月．

[2]王国建，李敏刚，马治平等，SPME结合衍生化检测尿液中吗啡成份[J]，刑事技术，2004:34-35．

[3]刘庆艳，罗芳苜，尿液中违禁药物的载体促进传递液相微萃取—高效液相色谱法测定[J]，分析测试学报，2009年（5）：23-26．

[4] Pedersen-Bjergaard S,Rasmussen Knut Einar．Liquid-phase microextraction w ith porous hollow fibers,a miniaturized and highly flexible format for liquid liquid extraction [J]．Journal of Chromatography A,2008,1184: 132-142．

[5]朱颖，陈璇，郑飞浪，白小红．三相中空纤维液相微萃取在羟基苯甲酸类化合物分析中的应用[J]，色谱，2009，27：56-60．

[6]Ho T S,Reubsaet J L E,Anthonsen H S, Pedersen-Bjergaard S,Rasmussen K E J．Liquid-phase microextraction based on carriermediated transportcombined w ith liquid chromatographymassspectrometry:new concept for thedetermination ofpolardrugsin asingledrop ofhuman plasma[J]．Chromatogr．A,2005,1072（1）29-36．

（责任编辑：于 萍）

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2095-7939(2015)03-0074-04

2015-04-07

王丹 （1978-），辽宁葫芦岛人，中国刑警学院禁毒学系副教授，中国人民公安大学在读博士生，主要从事禁毒学、毒品合成与检验方面的研究。