一贯煎单用及与化疗联用对荷H22肝癌小鼠MMP9和NF-κB蛋白表达的影响*

*基金项目：国家自然科学基金项目(81260523)；江西省研究生创新基金项目(YC2014-S275) ；江西中医药大学研究生创新基金项目(JZYC14A02)。

**第一作者：谢斌，男，副教授，博士，硕士生导师。研究方向：中医药抗肿瘤。

一贯煎单用及与化疗联用对荷H22肝癌小鼠MMP9和NF-κB蛋白表达的影响*

*基金项目：国家自然科学基金项目(81260523)；江西省研究生创新基金项目(YC2014-S275) ；江西中医药大学研究生创新基金项目(JZYC14A02)。

**第一作者：谢斌，男，副教授，博士，硕士生导师。研究方向：中医药抗肿瘤。

★谢斌**饶斌余功刘红宁***(江西中医药大学南昌 330004)

摘要：目的：观察一贯煎单用及与环磷酰胺联用对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB表达的影响。方法：雄性昆明小鼠40只，随机分为模型组、化疗组、一贯煎组、一贯化疗联合组。腋下注射H22细胞，建立H22荷瘤模型，一贯煎组造模前两周开始用药[剂量为23g mg/(kg·d)]，化疗组[剂量为50mg/(kg·d)，隔日1次]，一贯化疗联合组造模后用药，造模14d后处死小鼠称重，取瘤组织称重计算瘤指数，取脾组织称重计算脾指数，免疫组化检测MMP9、NF-κB蛋白的表达。结果：化疗组、一贯煎组及一贯化疗联合组均具有明显的抑瘤作用，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；一贯煎组脾指数增大，与化疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)；一贯化疗联合组能减少MMP9蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；化疗组、一贯煎组、一贯化疗联合组均能减少NF-κB蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论：一贯煎、环磷酰胺及其二者联用均具有抗肿瘤的作用，且均能减少NF-κB蛋白的表达而抑制肿瘤细胞的生长，但只有在二者联用的情况下才具有降低肝癌组织MMP9蛋白表达的作用，这可能会减少肝癌细胞的转移。

关键词：一贯煎；环磷酰胺；肝癌；MMP9；NF-κB

肝癌是外科疾病中的常见病和多发病，其发病率和死亡率位居癌症中第二位，且我国发病人数居世界首位[1]。中医认为肝癌病机为阴虚肝郁，滋阴疏肝经典方剂一贯煎联合化疗在临床肝癌患者的治疗中已被证实有疗[2]，但一贯煎单用是否具有抗肝癌作用？其与化疗联合对肝癌的影响是什么？这些问题尚不清楚。本研究拟观察一贯煎单用及与化疗药环磷酰胺联用对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB表达的影响，探索其作用机制，为其临床防治肝癌的应用奠定基础。

1材料

1.1动物及瘤株 动物：SPF级雄性KM小鼠,体重20±2g,江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(赣)2011-0001。瘤株：小鼠H22肝癌细胞来源：中国医学科学院肿瘤细胞库提供。

1.2药物及制备一贯煎：北沙参10g，麦冬10g，当归身10g，生地黄30g，枸杞子12g，川楝子5g(购于江西省中医院中药房)。将以上中药加10倍量的清水浸泡1h，然后煎煮，水沸后以小火煎40min，过滤；第二次加8倍量的清水煎熬，水沸后小火煎40min，过滤，合并滤液，常压浓缩至67mL(即每毫升药液含1.15g原药)，冷却后密封，4℃保存备用。实验药物浓度为23g/(kg·d)。阳性药物为环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX，批号13111325)0.2g/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司提供。CTX药物浓度为50mg/(kg·d)，隔日1次。

1.3试剂及仪器抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(Dako Denmark A/S，批号20140425)；NF-κBp65一抗(proteintech，批号00017138)；MMP9一抗(proteintech，批号00020746)；二抗HRP标记山羊抗兔(谷歌生物，批号20140415)；BSA(Roche，批号3200687)；倒置显微镜(LEICA,DMI3000B)；切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)；烘箱(上海福玛实验设备有限公司，DGX-9003B)；脱色摇床(北京六一仪器厂，WD-9405A)；普通光学显微镜(重庆光电仪器有限公司，XSP-C204)。

2方法

2.1肝癌H22细胞接种方法小鼠肝癌H22细胞的培养及传代：将腹水型小鼠肝癌H22细胞，于37℃、5%CO2培养箱，用含10% FCS的RPMI 1640完全培养基悬浮培养。取最佳生长状态的小鼠肝癌H22细胞，浓度调为5×106个/mL，以0.2 mL/只(1×106个细胞/只)无菌注入小鼠腹腔进行接种传代，于接种7～9d，小鼠腹部膨隆，出现腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接种。

2.2动物模型制作荷H22肝癌小鼠模型的建立[3]：将接种H22瘤种7～9d，腹部隆起明显的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，以无菌生理盐水稀释后，1500 r/min离心5 min，调整瘤细胞浓度为5×106个/mL，于小鼠右腋下行皮下无菌接种，接种量为每只0.2 mL/只。

2.3动物分组造模结束后，小鼠随机分为模型组、化疗组、一贯煎组、一贯化疗联合组，每组10只。

2.4给药模型组接种24h后，以0.2mL生理盐水灌胃，每天两次；化疗组接种24h后，CTX以50mg/(kg·d)剂量隔日腹腔注射；一贯煎组造模前两周即开始按23g/(kg·d)灌胃给药，每天两次；一贯化疗联合组接种24h后，一贯煎按23g/(kg·d)灌胃给药，每天两次，CTX以50mg/(kg·d)剂量隔日腹腔注射。2w后，处死各组小鼠并称重，取瘤组织及脾脏称重。

2.5免疫组织化学法肿瘤组织检测MMP9、NF-κB蛋白的表达水平组织切片、脱蜡、水化、洗涤、抗原修复、洗涤、灭活酶、洗涤、5% BSA封闭，加入一抗分别为MMP9(1:100)、NF-κB (1:100)，4℃过夜孵育14h；第2d室温复温3h后，PBS漂洗3×5 min；加入二抗，4℃孵育50 min；漂洗，DAB显色；漂洗，苏木素复染，贴片，脱水和透明，中性树胶封片。以LEICA倒置显微镜拍照，每张标本按顺序选5个视野，Image-Pro Plus 6.0分析，用平均光密度(D)表示阳性物质的相对含量。

3结果

3.1一贯煎协同CTX对荷H22肝癌小鼠瘤指数及脾指数的影响结果见表1。

结果表明化疗组、一贯煎组及一贯化疗联合组均具有明显的抑瘤作用，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；一贯煎组脾指数增大，与化疗组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.2一贯煎协同CTX对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB蛋白表达的影响结果见表2。

结果显示一贯化疗联合组能减少MMP9蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；化疗组、一贯煎组、一贯化疗联合组均能降低NF-κB蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表1　一贯煎单用及联合CTX对荷H22肝癌小鼠瘤指数及脾指数的影响±s)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与化疗组比较，#P<0.05；实验过程中，化疗组及一贯煎组均有1只小鼠死亡。

表2　一贯煎单用及联合CTX对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB蛋白的表达的影响±s)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；实验过程中，化疗组及一贯煎组均有1只小鼠死亡。

4讨论

肝癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不降，如何提高肝癌的临床治疗效果是当今医学领域迫切需要解决的重大课题之一。中医学在肝癌的治疗上具有十分重要的地位，中医学认为肝癌病机为阴虚肝郁，临床上的肝癌患者亦多表现为阴亏液涸伴肝气郁结，故治疗应滋阴疏肝。一贯煎是滋阴疏肝名方，方中滋阴养血药与疏肝理气药同用，补肝与疏肝相结合，被誉为涵养肝阴之第一良药，成为历代医家治疗肝病之首崇，且当下亦常有用其于抗肝癌的临床报道[4-5]。

附图　一贯煎单用及联合CTX对荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-kB蛋白表达的影响(免疫组化)

式促进肿瘤浸润及转移，因此抑制其表达可能会有效地抑制肿瘤的侵袭和转移[10]。NF-κB是近年来研究发现的导致肿瘤发生发展的关键诱因之一[11]，能通过对相应基因的转录调节，促进肿瘤的发生、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[12]，亦可促使肿瘤产生放化疗抵抗而影响治疗效果。

本研究结果表明化疗组、一贯煎组及一贯化疗联合组均具有明显的抑瘤作用，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；一贯煎组脾指数增大，与化疗组比较差异具有统计学意义(P<0.05); 一贯化疗联合组能减少MMP9蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；化疗组、一贯煎组、一贯化疗联合组均能降低NF-κB蛋白的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。由此可见，一贯煎、环磷酰胺及其二者联用均具有抗肿瘤的作用，且均能减少NF-κB蛋白的表达而抑制肿瘤细胞的生长，但只有在二者联用的情况下才具有降低肝癌组织MMP9蛋白表达的作用，这可能会减少其肝癌细胞的转移。

参考文献

[1]刘毅. SIRT3在原发性肝癌中的表达及其抑瘤作用的研究[D].中南大学,2012.

[2]贾学平,司银梅,胡伟,等.中药联合化疗栓塞术治疗原发性肝癌临床观察[J].湖北中医杂志,2013, 35(2):7-8.

[3]刘海军,孙晋民,贾兰玲.杜香提取物抑制荷瘤H22小鼠生长的实验研究[J].中国老年学杂志,2011,31(19):3 743-3 744.

[4]潘国凤,张晓东,吴良村.一贯煎治疗中晚期肝癌机理探讨及临床应用[J].中医药临床杂志,2004, 12(6):585-587.

[5]杨云柯,仇冬则,王国骅,等.中药加味一贯煎提高原发性肝癌晚期患者生存率的临床研究[J].中国临床医学,2011,18(6):818-820.

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[7]Haynes BP,Straume AH,Geisler J,et al. Intratumoral Estrogen Disposition in Breast Cancer[J].Clin Cancer Res,2012,16(6):1790-1801.

[81]Tummalapalli P,Spomar D,Gondi CS,et al.RNAi-mediatedabrogation of cathep sin B and MMP -9 gene expression in a malignant meningioma cell line leads to decreased tumor growth,invasion and angiogenesis[J].Int J Oncol,2007,31(5):1 039-1 050.

[9]Yamada K.Endogenous modulators for drug dependence[J].Biol Pharm Bull,2008,31(9):1 635 -1 638.

[10]Xu TM,Cui MH,Xin Y,et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 on ovarian cancer metastasis[J].Chin Med J( Engl),2008,121(15):1394-1397.

[11]向阳芳,石敏,徐智.NF-κB的负性调控机制在肿瘤发展与治疗的研究进展[J].现代生物医学进展,2014, 14(16):3 153-3 157.

[12]De Winther MP,Kanters E,Kraal G,et al.Nuclear factor kappaB signaling in atherogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005,25(5):904-914.

Effect of Yiguanjian Single and Combined with Cyclophosphamide on MMP9,NF-κB Protein Expression in H22 Tumor-bearing Mice

XIE Bin, RAO Bin, YU Gong, LIU Hong-ning

JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China.

Abstract:Objective:To observe the effect of Yiguanjian single and combined with cyclophosphamide(CTX) on MMP9,NF-κB expression in H22 tumor-bearing mice. Method:40 male Kunming mice were divided into model group, CTX group, Yiguanjian group and the combination group. Animal models of H22 tumor-bearing mice was induced with the axillary injection of H22 cells, Yiguanjian group was started medication with two weeks before[23g/(kg·d)], CTX group[50mg/(kg·2d)] and the combination group started medication after modeling. After 14d modeling, killing the mice and weighing the tumor tissue and splenic tissue, calculation of the tumor and spleen index, testing the expression of MMP9,NF-κB protein on immunohistochemistry assay. Result:The CTX group,Yiguanjian group and the combination group have obvious antitumor effects, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05 or P<0.01);Yiguanjian group Spleen index increased, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05); The combination group have declined significantly on the expression of MMP9, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05); Yiguanjian group, CTX group and the combination group all have declined significantly on the expression of NF-κB, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.01). Conclusion:Yiguanjian, CTX and union all have antitumor effects, all can reduce the expression of NF-κB protein that inhibit the growth of tumor cells,but only in two were combined can reduced the expression of MMP9 protein in hepatocellular carcinoma, this may reduce the metastasis of tumor.

Key words:Yiguanjian; Cyclophosphamide;Liver Cancer;MMP9;NF-κB

收稿日期：(2015-06-01)编辑：翟兴英

中图分类号：R285.5

文献标识码：B

通信作者：***刘红宁，男，教授，博士生导师。研究方向：滋阴抗肿瘤。