血管内皮生长因子基因与习惯性流产的相关性

陈丽平，周美芳，吕杰强

（1．温州医科大学附属第二医院妇产科，浙江温州 325000；2．温州市中西医结合医院，浙江温州 325000）

凡妊娠不到20周、胎儿体质量不足500g而中止者，称为流产。自然流产连续发生3次或3次以上，称 为 习 惯 性 流 产 （recurrent spontaneous abortion，RSA）。妊娠发生流产1次的概率为15%～20%，1%～5%的孕妇出现RSA，其中40%～55%的RSA目前尚无明确病因［1］。

正常怀孕依赖于充足的胎盘循环和胎儿脉管系统。着床、胚胎发育和胎盘形成过程中，功能血管网络的正常发育需要不同类型细胞和各种生长因子之间复杂的相互作用。胎盘脉管系统异常可能会导致流产等并发症的发生［2］。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因是血管生成最重要的调节因子，在早期妊娠中起着至关重要的作用，包括刺激滋养层细胞的增殖、胚胎血管发育、母体和子宫中胎儿的血细胞生长［3］。VEGF是针对内皮细胞的一种特定的促细胞分裂剂和存活因子，并且还是生理和病理条件下血管生成的关键启动子。基因敲除实验表明，VEGF在胎儿和胎盘的血管生成中起到了核心作用。在妊娠期间，VEGF对于滋养细胞的增殖、胚胎脉管系统的发育和子宫内母体-胎儿血管增长是至关重要的［4］。尽管适当的血管生成是继续妊娠成功的必备条件，但是RSA患者中母胎血管发育和生长是否有异常变化仍然不清楚。最近，有研究探讨了VEGF基因多态性与RSA的相关性，并发现VEGF基因rs2010963位点基因型频率在RSA患者组和正常对照组存在显著差异［5-6］。然而，在中国汉族RSA患者人群中鲜有研究。

1 对象与方法

1．1 研究对象 241例RSA患者均为汉族，年龄25～42岁，平均年龄（32．36±4．18）岁。所有病例均经妇科、B超、子宫输卵管造影等检查，排除了生殖器官畸形、感染，无糖尿病、甲状腺功能亢进等其他内分泌病史，同时经狼疮抗凝因子及抗心磷脂抗体等自身抗体筛查，均为阴性者，以排除自身免疫性的复发性流产，诊断为RSA。以从我院体检中心收集的265例无亲缘关系的健康女性体检者作为正常对照组，汉族，年龄23～45岁，平均（33．10±5．26）岁。排除标准：参与其他药物临床试验；有神经系统疾病；有血液系统疾病；有肝肾损害；高血压患者；有吸烟史；有口服避孕药史。所有参与者签署知情同意书，并经我院伦理委员会批准。

1．2 方法 EDTA抗凝真空采血管收集外周血3～5mL，采用 TIANamp Blood DNA Kit全血基因组DNA提取试剂盒（天根，中国北京）提取基因组DNA，-20℃储存备用。SNP分型由上海邃志生物科技有限公司利用美国Sequenom公司的MassARRAY系统完成，该系统是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF）。PCR反应条件：94℃15 min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，共45个循环；最终72℃3min。PCR扩增后，剩余的dNTP将被去磷酸消化掉，反应体系包括1．53μL水、0．17μL SAP缓冲液、0．3单位碱性磷酸酶（Sequenom）。该反应在37℃进行40min，然后85℃5min使酶失活。单碱基延伸反应在下列条件下进行：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s5个循环，共40个循环；最后72℃3min。使用 MassARRAY Nanodispenser（Sequenom）将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP（Sequenom）上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析。最终结果由MassARRAY RT软件系统（版本号3．0．0．4）实时读取，并由 MassARRAY Typer软件系统（版本号3．4）完成基因分型分析。

1．3 统计学处理 病例组及对照组基因型哈迪温伯格平衡检验采用Pearson's卡方检验。SPSS 13．0软件计算病例组和对照组等位基因频率和基因型频率，Pearson's卡方检验两组间等位基因频率和基因型频率分布差异。block根据D′＞0．9以及r2＞0．8进行定义。单倍型构建采用Haploview 4．0软件进行构建。频率＜5%单倍型被排除不再进行统计学检验。Pearson's卡方检验两组间单倍型频率及群体间差异分布。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

VEGF基因10个多态性位点的基因型及等位基因频率分布均符合Hard-Weinberg平衡定律。连锁不平衡分析发现4个单倍型高度连锁（D′＞0．9，图1）：rs699947-rs1570360（单倍型1）；rs833069-rs3024998（单倍型2）；rs3025006-rs3025010（单倍型3）；rs3025020-rs3025030-rs3025039（单倍型4）。基因型及等位基因频率在两组中的分布及统计结果见表1。单倍型频率在两组中的分布及统计结果见表2～表5。

2．1 单位点分析 VEGF基因rs3025020（内含子6）及rs3025039（3′非翻译区）基因型及等位基因频率分布在习惯性流产组及正常对照组间有统计学差异（P＜0．05）。习惯性流产组rs3025020位点TT基因型频率（P＝0．001）及T等位基因频率显著高于正常对照组（P＝0．000 2，OR＝1．620，95%CI＝1．260～2．084）；习惯性流产组rs3025039位点TT基因型频率（P＝0．011）T等位基因频率显著高于正常对照组（P＝0．001，OR＝1．628，95%CI＝1．209～2．192）。

图1 VEGF基因10个SNPs位点连锁不平衡结果Fig．1 The LD plot of the ten SNPs in theVEGF gene

2．2 单倍型分析 连锁不平衡分析发现，习惯性流产组A-C单倍型（rs833069-rs3024998）频率显著低于正常对照组（P＝0．034）；习惯性流产组T-G-C单倍型（rs3025020-rs3025030-rs3025039）频率显著低于正常对照组（P＝0．032）；习惯性流产组C-G-C单倍型（rs3025020-rs3025030-rs3025039）频率显著高于正常对照组（P＝0．000 2）。

3 讨 论

人类胎盘是血管生成物质的丰富来源。VEGF在胎盘血管形成调控以及母体血管在妊娠适应中发挥重要作用［7］。RSA的蜕膜血管内皮中胎盘滋养层VEGF免疫反应性减弱，与人工流产的正常绒毛组织相比，宫内胚胎死亡病例中可观察到血管发育不良［8］。另一方面，VEGF与壁层蜕膜中血管密度增加与早期流产有关，表明VEGF在妊娠早期血管发育中起到关键作用［9-10］。

表1 VEGF基因10个SNPs位点基因型及等位基因频率在习惯性流产组及对照组中的分布Tab．1 Genotype and allele frequencies of the VEGF gene polymorphisms in cases and controls and the results of their associations with risk of RSA

表2 VEGF基因单倍型1（rs699947-rs1570360）在病例组及对照组中的频率分布Tab．2 VEGF haplotype frequencies in block 1 （rs699947-rs1570360）and their associations with risk of RSA

表3 VEGF基因单倍型2（rs833069-rs3024998）在病例组及对照组中的频率分布Tab．3 VEGF haplotype frequencies in block 2 （rs833069-rs3024998）and their associations with risk of RSA

表4 VEGF基因单倍型3（rs3025006-rs3025010）在病例组及对照组中的频率分布Tab．4 VEGF haplotype frequencies in block 3 （rs3025006-rs3025010）and their associations with risk of RSA

表5 VEGF基因单倍型4（rs3025020-rs3025030-rs3025039）在病例组及对照组中的频率分布Tab．5 VEGF haplotype frequencies in block 4 （rs3025020-rs3025030-rs3025039）and their associations with risk of RSA

VEGF是一种缺氧诱导分泌的细胞因子，通过与内皮细胞上的受体酪氨酸激酶相互作用，促进血管生成。人类VEGF基因位于染色体6p21．3，由8个外显子和7个内含子组成，并且经过选择性剪接形成的蛋白质家族［11］。VEGF基因多态性不仅与很多疾病有关，如巨细胞动脉炎、肾并发症过敏性紫癜以及妊娠相关疾病等［11］。

本研究结果表明，在病例及对照组中rs3025020基因型频率分布存在显著性差异。与对照组相比，RSA组TT基因型及T等位基因频率显著高于正常对照组。表明，VEGF基因rs3025020位点多态性是中国汉族女性RSA的遗传易感性因素，也是中国汉族女性RSA发病的风险因子。携带有T等位基因的女性可能更易患RSA。研究表明，VEGF基因变异会影响VEGF蛋白表达［12］。研究发现，rs3025020变异可能改变海马VEGF浓度［13］。有报道对rs3025020位点多态性与VEGF水平、RSA相关性进行了研究，表明纯合子rs3025020位点TT基因型携带者VEGF循环水平降低，这可能是因为rs3025020变异可能负性影响了转录速率，很大程度上是由于去除了一个VEGF最佳转录需要的DNA结合位点（包含rs3025020位点）［12］。这又引起VEGF产物减少，从而导致RSA的风险增加。总之，VEGF rs3025020位点多态性调节了VEGF的表达，影响RSA风险，从而证实了VEGF水平改变与RSA存在相关，扩展了RSA相关的VEGF多态性研究。

有趣的是本研究发现，在病例组及对照组中rs3025039基因型频率分布存在统计学差异。与对照组相比，RSA组TT基因型及T等位基因频率显著高于正常对照组。有关该位点是否对蛋白功能产生影响目前尚不清楚。在北美印第安人和希腊人中发现，GT基因型和894GT＋TT基因型使RSA发病风险增加。而对巴西及韩国人群体的研究结果表明该位点与RSA无相关性［5］。说明，rs3025039位点与RSA的相关性尚需更大的样本量在欧洲及亚洲人群中进一步研究。

单倍型分析发现，习惯性流产组C-G-C单倍型（rs3025020-rs3025030-rs3025039）频率显著高于正常对照组，表明携带VEGF基因C-G-C单倍型的患者更容易罹患RSA。习惯性流产组A-C单倍型（rs833069-rs3024998）频率显著低于正常对照组，习惯性流产组T-G-C单倍型（rs3025020-rs3025030-rs3025039）频率显著低于正常对照组，表明这两个单倍型可能是RSA的保护因素。因此，该发现进一步支持了VEGF多态性在RSA中的作用，虽然有可能存在民族和地域差异。

总之，遗传学研究有助于更好地理解RSA的潜在发病机制。我们的研究表明了VEGF基因及其相关的单倍型在RSA的遗传易感性中可能发挥潜在作用。这些SNPs是如何影响VEGF的功能尚待进一步的探讨，且需要在其他民族和地域群体中进一步重复研究验证。

［1］VAN DEN BERG MM，VISSENBERG R，GODDIJN M．Recurrent miscarriage clinics［J］．Obstet Gynecol Clin North Am，2014，41（1）：145-155．

［2］JELKMANN W．Pitfalls in the measurement of circulating vascular endothelial growth factor［J］．Clin Chem，2001，47（4）：617-623．

［3］CRAFTS TD，JENSEN AR，BLOCHER-SMITH EC，et al．Vascular endothelial growth factor：Therapeutic possibilities and challenges for the treatment of ischemia［J］．Cytokine，2014，S1043-4666（14）：00523-00527．

［4］WILLIAMS DJ，VALLANCE PJ，NEILD GH，et al．Nitric oxide-mediated vasodilation in human pregnancy［J］．Am J Physiol，1997，272（2 Pt 2）：H748-752．

［5］SAMLI H，DEMIR BÇ，OZGÖZ A，et al．Vascular endothelial growth factor gene 1154 G／A，2578 C／A，460 C／T，936 C／T polymorphisms and association with recurrent pregnancy losses［J］．Genet Mol Res，2012，11（4）：4739-4745．

［6］LI L，DONGHONG L，SHUGUANG W，et al．Polymorphisms in the vascular endothelial growth factor gene associated with recur-rent spontaneous miscarriage［J］．J Matern Fetal Neonatal Med，2013，26（7）：686-690．

［7］TORRY DS，LABARRERE CA，MCINTYRE JA．Uteroplacental vascular involvement in recurrent spontaneous abortion［J］．Curr Opin Obstet Gynecol，1998，10（5）：379-382．

［8］VINCENTI V，CASSANO C，ROCCHI M，et al．Assignment of the vascular endothelial growth factor gene to human chromosome 6p21．3［J］．Circulation，1996，93（8）：1493-1495．

［9］SLADEK SM，MAGNESS RR，CONRAD KP．Nitric oxide and pregnancy［J］．Am J Physiol，1997，272（2 Pt 2）：R441-463．

［10］刘俊霞，李艳．习惯性流产患者蜕膜和绒毛组织中VEGF的表达及意义［J］．山东医药，2008，48（26）：90-91．

［11］BLUMBERG HP，WANG F，CHEPENIK LG，et al．Influence of vascular endothelial growth factor variation on human hippocampus morphology［J］．Biol Psychiatry，2008，64（10）：901-903．

［12］MONCADA S，HIGGS A．The L-arginine-nitric oxide pathway［J］．N Engl J Med，1993，329（27）：2002-2012．

［13］RUGGIERO D，DALMASSO C，NUTILE T，et al．Genetics of VEGF serum variation in human isolated populations of cilento：importance of VEGF polymorphisms［J］．PLoS One，2011，6（2）：e16982．