微波辅助提取菱红菇多糖及抗氧化活性研究

王娅玲,李维峰,郭 芬,张传利,吴荣书

(云南农业大学热带作物学院,云南普洱 665000)



微波辅助提取菱红菇多糖及抗氧化活性研究

王娅玲,李维峰,郭 芬,张传利,吴荣书*

(云南农业大学热带作物学院,云南普洱 665000)

探讨菱红菇多糖微波辅助提取工艺,并研究其抗氧化活性。考察料液比、微波功率、微波时间对菱红菇多糖提取得率的影响,在单因素实验的基础上,利用正交实验设计对提取工艺参数进行优化,并对菱红菇多糖还原力和对羟自由基、亚硝酸根、超氧自由基的清除作用进行研究。实验结果表明,菱红菇多糖微波辅助提取最佳提取条件为水料比1∶40(g/mL),微波功率500W,微波时间7min,,在此条件下多糖平均得率为7.82%。菱红菇多糖具有较强的还原能力和清除羟自由基、亚硝酸根、超氧自由基的能力。尽管菱红菇多糖抗氧化性低于VC,但可作为潜在的天然抗氧化剂应用于食品工业中。

菱红菇,多糖,微波,提取,抗氧化活性

多糖是由多个单糖聚合而成的大分子化合物,作为生命活动的四大基本物质之一,对生命有机体具有重要的意义。自Brander研究发现酵母细胞壁多糖具有抗肿瘤活性之后,人们做了大量关于真菌多糖生物活性的研究。研究发现,真菌多糖具有抗肿瘤、增强机体免疫力、降血脂、降血糖等生理功能[1]。

菱红菇(Russulavescafr.),别名细弱红菇,属担子菌门、担子菌纲、红菇目、红菇科、红菇属[2],广泛分布于江苏、福建、云南、广西等地,可食用,质地脆嫩,味道鲜美,亦可入药,具有和胃气、祛风、破血、缓冲等药效[3]。目前国内外对红菇属真菌开展了一定的研究[4-7],但是对菱红菇多糖的提取分离及其抗氧化活性的研究却还未见报道。本实验以野生菱红菇为实验材料,研究了菱红菇多糖的微波辅助提取技术,通过正交实验[8]优化提取工艺,并对菱红菇多糖的抗氧化活性进行了测定,为进一步开发菱红菇的药用保健功能提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菱红菇 野生菱红菇采集于云南省普洱市山地栗木杂生林下;浓硫酸、无水乙醇、丙酮、苯酚、乙醚、氯仿、三氯乙酸、磷酸等试剂 均为分析纯。

电子天平 梅特勒AL204;冷冻离心机 中科中佳HC-3618R;分光光度计 上海精科UV759;微波炉美的EG823MF4-NA;真空干燥箱 上海一恒DZF-6053;万能粉碎机 北京中兴伟业FW-200;电热鼓风箱 上海一恒DHG-9620A;水浴锅 上海一恒HWS-24。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的处理 将野生菱红菇洗净泥沙及粘附的杂物后65℃烘干,高速中药粉碎机粉成粉末,过70目筛,按照1∶3(g/mL)比例加入无水乙醚连续回流萃取2h,抽取脂肪,于烘箱中60℃烘干后再按照1∶3(g/mL)比例加入85%乙醇连续回流萃取2h,去除单糖、低聚糖等杂质,再于烘箱中60℃烘干备用。

1.2.2 单因素实验 预处理后的菱红菇粉末通过基本实验条件:微波功率400W,加水按料液比1∶40(g/mL),微波处理时间50min,分别研究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、不同微波功率(200、300、400、500、600、700W)、不同微波时间(2、3、4、5、6、7min)对菱红菇多糖得率的影响。

1.2.3 菱红菇多糖微波正交实验设计 在上述单因素实验基础上,选择浸提料液比、微波功率和微波时间3个因素按照L9(34)设计三因素三水平实验(如表1)。

表1 正交实验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 菱红菇多糖提取方法 菱红菇→洗净60℃烘干→粉碎→过70目筛→去除脂质及单糖等杂质→微波浸提→抽滤→滤液测定多糖含量→Sevage法去蛋白→水相加入乙醇,4℃沉淀过夜→4℃冷冻离心→沉淀→依次用95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤两次→60℃真空干燥至恒重→菱红菇多糖。

1.2.5 菱红菇多糖得率的计算及标准曲线的绘制 采用苯酚-硫酸法[9]。准确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1000g,蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶定容,摇匀,配成1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别吸取2、4、6、8、10mL葡萄糖标准溶液定容到50mL,分别吸取定容后葡萄糖溶液0.8mL于25mL具塞比色管中,以蒸馏水为空白对照,各加新鲜配制5%苯酚0.8mL,摇匀,再加入98%浓硫酸5mL,震荡摇匀,40℃水浴加热30min,冷却至室温,490nm处测定吸光度,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程y=7.1713x+0.0043(R2=0.9991)。

精确吸取抽滤得到的定容好的菱红菇多糖溶液0.8mL,按照上述方法测定吸光度值,代入回归曲线计算多糖含量,并按照下面公式计算多糖得率:

菱红菇多糖得率(%)=(提取液中多糖质量/原料质量)×100

1.2.6 抗氧化活性测定 将提取得到的菱红菇多糖配成50、100、200、400、600、800、1000μg/mL不同浓度的溶液进行如下抗氧化活性实验:还原能力测定采用铁氰化钾还原法[10],羟基自由基清除能力测定采用Fenton反应—分光光度法[11],亚硝酸根清除能力测定采用盐酸萘乙二胺法[12],超氧阴离子的清除作用采用邻苯三酚自氧化法[13]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对多糖得率的影响 由图1可以看出,菱红菇多糖的得率随着料液比的增加而增加,提取液比例越高,则多糖溶出平衡越向水相中移动,多糖得率越高,当料液比达到1∶40(g/mL)后,菱红菇多糖达到提取得率最大值,之后再增加提取液比例,得率会略有降低,原因可能是溶剂增加会引起能量的额外损耗,导致在固定微波功率下溶剂温度上升较慢,同等提取时间下得率下降。因此确定最佳料液比为1∶40(g/mL)。

图1 料液比对多糖得率的影响Fig.1 Effect of the ratio between material and solvent on polysaccharides extraction rate

2.1.2 微波功率对多糖得率的影响 由图2可以看出,在200～500W范围内,随着微波功率的增加,菱红菇多糖的得率不断升高,但当微波功率超过500W后,多糖得率反而开始下降,原因可能是微波功率过高,导致原料细胞内过快的微波热效应会破坏多糖的结构,从而导致多糖降解,从而使得多糖得率下降,因此选择500W为最佳微波提取功率。

图2 微波功率对多糖得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharides extraction rate

2.1.3 微波时间对多糖得率的影响 从图3可以看出,微波作用时间2～6min范围内多糖得率随微波时间的延长而增加,在微波时间达到6min时达到最大值,之后继续微波提取得率会有所降低,其原因是微波长时间作用于多糖分子而使其结构发生改变,产生降解,从而导致多糖得率下降,所以选定6min为最佳微波时间。

图3 微波时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of microwave times on polysaccharides extraction rate

2.2 菱红菇多糖微波提取工艺的正交实验结果

以菱红菇多糖得率为评价指标,使用正交设计助手Ⅱ进行数据统计分析,实验结果见表2。

表2 微波提取正交实验结果Table2 The results and analysis of orthogonal test

通过极差R值的比较可以看出,影响菱红菇多糖得率因素的主次顺序为:料液比>微波时间>微波功率,菱红菇多糖的微波提取最佳条件是A2B2C3,即料液比为1∶40(g/mL),微波功率为500W,微波时间为7min。在此条件下对菱红菇多糖进行3次平行提取实验,多糖得率分别为7.76%、7.83%、7.88%,平均值为7.82%,高于正交实验中所有多糖得率且重现性好,表明该条件稳定可行。

2.3 菱红菇多糖抗氧化指标测定结果

2.3.1 还原力的测定 抗氧化剂的还原能力与其抗氧化活性之间有着明显的相关性,抗氧化剂还原力越大,抗氧化能力越强,因此可以根据还原力的大小判断抗氧化剂的抗氧化能力强弱。由图4可以看出,在0～1000μg/mL范围内,菱红菇多糖还原能力随着浓度的增大而升高,但是其还原能力与VC相比则显得较弱,在600μg/mL的浓度下其还原力与100μg/mL的VC还原力相当。

图4 多糖的还原力Fig.4 Reducing power of polysaccharides

2.3.2 羟基自由基清除能力测定 在生物体内,羟自由基反应活性很强,它可以导致细胞膜系统氧化,并与生物大分子反应,造成细胞损伤乃至死亡[14]。由图5可以看出菱红菇多糖对·OH的清除能力随浓度的增加而升高,在多糖浓度1000μg/mL时,清除率达到56.25%,表现出较强的羟自由基清除能力。

图5 多糖对·OH的清除作用Fig.5 ·OH scavenging capability of polysaccharides

图6 多糖对亚硝酸根离子的清除作用Fig.6 The scavenging capability of

2.2.3 亚硝酸根清除能力测定 亚硝酸盐广泛存在于腌制品中,其进入人体后会转化为强致癌物亚硝胺[15],由图6可知,菱红菇多糖对亚硝酸盐具有一定的清除作用,在1000μg/mL浓度下菱红菇多糖亚硝酸盐清除率为45.61%,但同等浓度的VC清除率为98.15%,因此菱红菇多糖的清除亚硝酸铬能力明显弱于VC。

2.2.4 超氧阴离子清除能力测定 由图7可以看出,菱红菇多糖对超氧阴离子具有较好的抗氧化活性,其对超氧阴离子的清除率随着浓度的增大而增加,在菱红菇多糖浓度为1000μg/mL时,清除率达到56.01%。

图7 多糖对超氧阴离子的清除作用Fig.7 The scavenging capability of

3 结论

本研究通过单因素实验考察了浸提料液比、微波功率和微波时间对菱红菇多糖提取得率的影响,通过正交实验确定了影响得率的主次顺序为料液比>微波时间>微波功率,最佳提取条件为料液比为1∶40(g/mL),微波时间为7min,微波功率为500W，多糖得率为7.82%。菱红菇多糖对亚硝酸盐、羟自由基和超氧自由基都有一定的清除作用,而且具有量效关系,其中对羟自由基和超氧自由基的清除能力较强,说明菱红菇多糖具有一定的抗氧化活性。

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Study on microwave-assisted extraction and the antioxidant activities of polysaccharide fromRussulavesca

WANG Ya-ling,LI Wei-feng,GUO Fen,ZHANG Chuan-li,WU Rong-shu*

(Faculty of Tropical Crops,Yunnan Agricultural University,Pu’er 665000,China)

Russulavesca;polysaccharide;microwave;extraction;antioxidant activity

2014-08-11

王娅玲(1985-)，女，本科，助教，主要从事环境化学和食品化学方面的研究。

*通讯作者:吴荣书(1960-)，女，学士，教授，主要从食品安全与质量控制方面研究。

云南农业大学热带作物学院科研基金资助项目(019RY2014001)。

TS201.2

B

:1002-0306(2015)09-0251-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.046