SP对帕金森小鼠脾脏结构及抗氧化功能的影响

吴 超，高贵珍，单玲玲，李红侠

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000



SP对帕金森小鼠脾脏结构及抗氧化功能的影响

吴 超，高贵珍*，单玲玲，李红侠

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

[目的]探讨硫酸化茯苓多糖(SP)对MPTP诱导的帕金森小鼠脾脏结构和抗氧化功能的影响。[方法]将ICR小鼠随机分为对照组、MPTP组和治疗组(三组)，实施腹腔注射给药，处死取小鼠脾脏，HE染色观察各组小鼠脾脏结构的变化，利用酶标仪检测小鼠脾脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)的活性、抗超氧阴离子活力及丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量。[结果]MPTP组小鼠脾脏红髓比例升高，充血明显，脾脏组织抗氧化酶活性、抗超氧阴离子的活力明显下降，MDA、H2O2含量升高。治疗组中小鼠脾脏淋巴小结体积增大，充血现象减轻，脾脏中各种抗氧化酶活性及抗超氧阴离子的活力均有不同程度的增强，MDA、H2O2含量降低。[结论]SP可以缓解帕金森小鼠脾脏损伤，提高脾脏抗氧化能力。

SP；MPTP；抗氧化；HE染色

帕金森病(PD)又被称为震颤麻痹，是一类主要发生在中老年龄阶段的慢性疾病，随年龄增长，发病率具有增加的趋势。PD是一种慢性运动障碍性病症，患者临床病状有静止性震颤、局部或全身性肢体不受控制、姿势平衡障碍等，严重者会伴有记忆功能衰退、行动迟缓和肢体僵直[1-3]。其主要病因是中脑中黑质和纹状体的病理性病变，脑内多巴胺分泌量减少，从而导致多巴胺能神经元的凋亡。脾脏是所有脊椎动物中产生致敏淋巴细胞和抗体的最主要的淋巴器官，能通过多种调节机制起到吞噬异物、免疫调节和抗肿瘤的保护作用。中医学将帕金森病归于虚损的范畴，以肝肾脾阴虚的病机去认识PD，认为脾脏是后天之本，脾虚则气血亏乏，四肢容易出现颤震[2]，故脾阴虚是PD的病机关键，脾虚在PD病发生发展过程中起着重要的作用。目前帕金森病治疗药物左旋多巴胺等都有一定的毒副作用，长期服用甚至会引起神经系统功能障碍。相关临床医学表明[4-6]，通过健脾益气、养脾阴法等方法能在一定程度上缓减帕金森的症状，减轻西药的毒副作用，因此，开发中药预防治疗帕金森病有重要的意义。

药用茯苓是一种具有抗氧化、抗肿瘤的免疫活性调节作用的菌核，有健脾的独特功效，而茯苓多糖也是目前研究较为广泛的天然多糖之一，硫酸化茯苓多糖(SP)是单糖分子上的某些羟基被硫酸根所取代的一类多糖衍生物，有研究表明它在抗肿瘤、增强机体免疫力等方面都有良好的临床治疗效果[7-8]。本文作者前期已开展了SP急性毒性试验、体内代谢及其对慢性肾功能衰竭的防治作用等方面研究，但有关SP对帕金森小鼠脾脏结构和抗氧化功能的影响鲜见报道。

MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)是一种神经毒素，其本身并没有毒性，仅仅是一种能通血脑屏障的普通脂溶性有机化合物。但是，当MPTP进入大脑之后，会被神经胶质细胞产生的单胺氧化酶B代谢成有毒的阳离子MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)。MPP+不仅能杀死黑质致密部产生多巴胺的神经元，还能干扰线粒体代谢中相关酶的功能。MPTP可产生类似于帕金森症的病理学病症，是成熟稳定的帕金森建模诱导剂[7]。本文以MPTP诱导ICR小鼠建立帕金森氧化模型，通过观察小鼠脾脏的病理特征变化和检测小鼠脾脏中GSH-Px、CAT、SOD、抗超氧化物阴离子活力以及MDA、H2O2的含量，探讨SP对MPTP诱导的帕金森小鼠脾脏结构和抗氧化功能的影响，揭示其潜在的帕金森治疗效应，为神经保护药物开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

扫描酶标仪(Sunrise奥地利TECAN)，倒置荧光显微镜(OLYMPUSIX71，日本奥林巴斯)，切片机，超低温冰箱(DW-HW138，中科美菱)，冷冻研磨机(Cryomill，德国莱驰)，冷冻离心机(Neofuge23R/TGL-16G，香港力康/上海安亭)。

MPTP来自于Sigma公司，硫酸化茯苓多糖由合肥学院馈赠，苏木精染色液、伊红染色液、95%和无水乙醇、浓盐酸、0.01mol/LPBS、二甲苯。SOD、GSH-Px、CAT、MDA、H2O2以及超氧阴离子活力活性检测试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药

40只雄性ICR小鼠，体重控制在25～30g范围内，购于安徽医科大学。

表1 动物分组及给药方案

1.2.2 处死与匀浆

停药后在第18天用引颈处死法处死各组小鼠，取小鼠脾脏，剪碎组织，按重量体积比1∶9加入0.9% 生理盐水，置于冷冻研磨机中粉碎离心，转速设置为2 500～3 000r/min，离心10min，取匀浆上清备用。

1.2.3 小鼠脾脏的冷冻切片及HE染色

取各组小鼠脾脏组织，4%多聚甲醛PBS固定，石蜡包埋，冷冻切片机切出5μm完整横切面切片，按HE染色流程染色。

图1 脾脏石蜡切片HE染色步骤

1.2.4 氧化相关指标的测定

分别测定各组小鼠脾脏GSH-Px、CAT、SOD活性、抗超氧阴离子的活力以及MDA及过氧化氢的含量，按试剂盒方法进行，利用酶标仪测定OD值，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，根据公式计算各指标。

1.3 统计学分析

数据采用One-wayANOVA检验进行组间显著性分析比较，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01为差异显著，P<0.001为差异极显著。

2 实验结果

2.1SP对小鼠脾脏结构的影响

由脾脏病理照片可知：对照组红髓和白髓界限清晰并且易于观察，二者比例属于正常，淋巴小结体积比较大，其中淋巴细胞较为稠密。MPTP模型组红髓和白髓界限不明显，红髓比例增高，脾血窦扩张，充血比较明显，说明模型组动物脾脏受到损伤。与MPTP模型组相比，SP治疗组均能显著增大淋巴小结体积，经SP治疗后，红、白髓界限比较清晰，充血现象有所减轻，说明SP在一定程度上能缓解脾脏的损伤。

图2 SP对小鼠脾脏结构的影响(×100)

图3 SP对小鼠脾脏SOD酶活力的影响

2.2SP对小鼠脾脏SOD活性的影响

与对照组(46.22±5.10)相比，MPTP组(22.96±9.94)SOD酶活性降低，有统计学意义(P<0.05)；与MPTP组相比，SP低、中、高浓度治疗组(33.34±4.38、44.34±7.44、33.52±10.38)SOD酶活性增大，其中SP为100mg/kg时差异有统计学意义(P<0.05)。表明一定浓度的SP可以提高脾脏SOD活性，增强脾脏的抗氧化能力，但高浓度的SP具有一定的毒性。

2.3SP对小鼠脾脏GSH-PX活性的影响

图4是SP对小鼠脾脏GSH-PX酶活力的影响，从图可见，与对照组(472.01±37.84)相比，MPTP组(332.41±56.81)小鼠脾脏GSH-PX活性降低，有统计学意义(P<0.05)，实施50～150mg/kg梯度浓度SP治疗后，脾脏组织中的GSH-PX活性(444.58±7.70、492.26±41.33、385.16±7.23)都有所提高，其中50、100mg/kg时，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 SP对小鼠脾脏GSH-PX酶活力的影响

2.4SP对小鼠脾脏CAT活性的影响

图5 SP对小鼠脾脏CAT活性

图5是SP对小鼠脾脏CAT酶活力的影响，从图可见，与对照组(49.28±6.62)相比，MPTP组小鼠脾脏中的CAT酶活性降低，有统计学意义(P<0.05)，与MPTP组相比，SP浓度在100mg/kg以下时，CAT酶活性(51.05±8.90、45.42±2.17)有提高，有统计学意义(P<0.05)，SP对CAT酶活性影响明显，且50mg/kg差异最明显(P<0.01)，但随着SP浓度的增加，CAT酶的活性却有明显的下降趋势，进一步说明高浓度的SP具有一定毒性。

2.5SP对小鼠脾脏抗超氧阴离子活性的影响

按照抗超氧阴离子活力单位计算公式，测定对照组、MPTP组、SP治疗组抗超氧阴离子活性，由图可见，与对照组(1.53±0.13)相比，MPTP组(0.387±0.11)抗超氧阴离子活性极显著降低(P<0.001)，SP三个治疗组(0.814±0.21、1.085±0.28、0.742±0.16)的抗超氧阴离子活性都有明显提高(P<0.05)，100mg/kg时差异显著(P<0.01)，但随着浓度的升高，呈下降趋势,高浓度SP有一定毒性。

图6 SP对小鼠脾脏抗超氧阴离子活力影响

2.6SP对小鼠脾脏MDA含量的影响

图7 SP对小鼠脾脏MDA含量的影响

图7为SP对小鼠脾脏MDA含量的影响，与对照组(0.083±0.015)相比，模型组(0.252±0.058)MDA含量显著提高(P<0.001)，与模型组相比，当SP浓度在50～100mg/kg时，MDA含量(0.085±0.016，0.068±0.019)显著降低(P<0.001)，当SP浓度在150mg/kg时，MDA含量(0.135±0.026)降低，有统计学意义(P<0.05)，但与低、中浓度相比，MDA含量升高，说明高浓度SP有一定毒性。

2.7SP对MPTP诱导小鼠脾脏H2O2含量的影响

图7为SP对小鼠脾脏H2O2含量的影响，与对照组(107±15)相比，模型组(132±32)H2O2含量有提高，有统计学意义(P<0.05)，与模型组相比，SP治疗组H2O2含量(112±26，97.4±19，96.2±17)有所降低，有统计学意义(P<0.05)，随着SP浓度的增加，H2O2含量稍有降低，但差别不明显。

图8 SP对小鼠脾脏过氧化氢含量的影响注：与对照组相比，#P<0.05；与MPTP组相比，*P<0.05。

3 讨论

帕金森病是一种进展缓慢的慢性退行性病变，从中医角度看，久病人络，久病多痊，血流滞缓，瘀血阻络是帕金森病的重要病机。脾为后天之本，气血生化之源，五脏之中心，健脾可益气养血、化痰通络、潜阳熄风[2]。马云枝等人据此研制的熄风定颤丸，治疗帕金森病具有明显的疗效；与西药美多巴等配合应用，具有减毒增效的作用[2]。茯苓多糖不但具有抗氧化、抗肿瘤的免疫活性，而且有着健脾的独特功效，因此从脾脏结构和抗氧化功能入手来研究硫酸化茯苓多糖对帕金森病是否有治疗效果具有科学依据。运用中医中药治疗帕金森病，长期以来在我国国民保健体系中起着举足轻重的作用，也是我国临床医学的一大特色。

研究表明，氧化应激释放大量活性氧自由基(ROS)、相关蛋白的异常表达和聚集等都有可能是PD病的发病基础。ROS对细胞具有很强的毒性，可破坏生物膜结构，从而影响正常的细胞功能，并可能导致细胞凋亡。本文中检测了抗氧化酶体系中的GSH-Px、SOD和CAT的活性，这些指标在机体清除ROS的过程起着重要的作用，在一定程度上反映了细胞的活性状态。此外，超氧阴离子自由基、MDA和过氧化氢等相关指标水平可以反映出细胞的受损程度。通过检测上述指标可以有效地反应脾脏组织的活力状态。实验结果显示，MPTP组小鼠脾脏红髓比例升高，充血明显，脾脏组织抗氧化酶(GSH-Px、SOD、CAT)活性、抗超氧阴离子的活力明显下降，MDA、H2O2含量升高，表明帕金森小鼠建模成功。50、100、150mg/kgSP治疗后，小鼠脾脏淋巴小结体积增大，充血现象减轻，脾脏中各种抗氧化酶活性和抗超氧阴离子的活力均有不同程度的增强，而MDA、H2O2含量降低。在SP三个浓度组中，100mg/kg治疗效果比较明显，100～150mg/kg的效果无显著差异，且多个检测参数在SP为150mg/kg时有下降趋势，综上所述，SP在50～100mg/kg时对MPTP诱导的帕金森小鼠脾脏有保护作用，但较高浓度SP有一定的毒害作用。笔者认为，SP可以缓解帕金森小鼠脾脏损伤，提高脾脏抗氧化功能。本文研究结果为开发神经保护药物提供理论依据。

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(责任编辑：汪材印)

2015-10-09

安徽省教育厅自然科学研究项目(KJ2013A242、KJ2014A249)；安徽省自然基金面上项目(1308085MG136)；宿州学院博士启动基金(2014jb05 )宿州学院药物生物技术研究所开放平台项目“蓝莓花色素苷的提取及抗癌活性的研究”(2014KYF31)。

吴超(1985-)，安徽无为人，博士，讲师，主要研究方向：动物免疫。

R285

：A

：1673-2006(2015)12-0111-04

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.12.030