河南省20株布鲁氏菌鉴定与PFGE分子分型研究

赵嘉咏,苏 佳,张白帆,夏胜利,穆玉姣,呂家锐,黄学勇

河南省20株布鲁氏菌鉴定与PFGE分子分型研究

赵嘉咏,苏 佳,张白帆,夏胜利,穆玉姣,呂家锐,黄学勇

目的 检测与分析河南省2010-2012年20株布氏菌型别及PFGE脉冲场凝胶电泳指纹图谱特征。方法 采集病人静脉血，分别以试管凝集试验(SAT)、双相血培养瓶分离培养、热裂解法制备DNA模板和AMOS-PCR鉴定4种布氏菌型别。采用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对检出的布鲁氏菌进行分子分型鉴定。结果 分离培养的20株布鲁氏菌经鉴定，19株为羊种，1株为牛种；羊种布鲁氏菌经XbaI酶切与脉冲场凝胶电泳后，共获得了8种不同带型，带型相似度在80%～100%之间，牛种与羊种菌株在带型相似度上差异较大，具有较好的分辨能力。结论 河南省病人感染的布鲁氏菌以羊种为主要型别，AMOS-PCR与PFGE作为布鲁氏菌菌型鉴定与分子分型的技术手段，为布鲁氏菌病的病原学监测与应急检测提供依据。

布氏菌；AMOS多重PCR；PFGE

布鲁氏菌病(brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体，引起的人兽共患变态反应性疾病，是中华人民共和国传染病防治法规定报告的乙类传染病。近年来我国动物间和人间布病疫情有回升势头。本研究对2010-2012年内分离自河南省监测哨点医院的20株布鲁氏菌进行分子生物学检测、分型，为深入了解和掌握布鲁氏菌的病原构成、分子流行病学特征和相关疾病的监测、暴发预警、调查、溯源提供基线与参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 自2010-2012年河南省监测哨点医院与河南省疾控中心发热门诊采集的布鲁氏菌试管凝集法(SAT)阳性病人血液样本。标准菌株16M 、544A、1330S 由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所布病室赠送。

1.1.2 主要试剂 双相血培养瓶购自法国bioMerieux公司；裂解绵羊血平板购自安图生物公司；TaqDNA聚合酶购自美国Promega公司；引物(HPLC纯化)由Invitrogen合成；Seakem Glod琼脂糖购自美国LONZA公司；蛋白酶K购自英国Roche公司；限制性内切酶XbaI购自大连宝生物公司；Tris-Hcl/EDTA/5XTBE购自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离培养 病人新鲜血液5～8 mL，无菌注射接种于双相血培养瓶，混匀后置37 ℃ 恒温培养箱中培养，每隔2 d观察1次，有菌生长时挑出菌落转种绵羊血琼脂中培养。

1.2.2 形态学与生化鉴定 挑取可疑菌落进行革兰氏染色、镜检与H2S试验。G-为短小杆菌，H2S+为疑似布鲁氏菌。

1.2.3 DNA模板制备 刮取布鲁氏菌培养物，0.85%灭菌生理盐水调节菌浓至1麦氏浊度，充分振荡悬浮。2 ℃～8 ℃，12 000 r/min离心5 min，弃去上清。沉淀加入100 μL灭菌去离子水，再次充分振荡悬浮混匀。100 ℃煮沸15～20 min，12 000 r/min离心5 min，上清作为PCR扩增模板[1]。

1.2.4 AMOS-PCR检测 反应体系为50 μL：其中PCR反应液(含有Taq酶、特异性引物、 dNTP及反应缓冲液)46 μL，模板DNA 4 μL。检测引物针对布鲁氏菌不同亚种设计，引物浓度IS711-specific primer 1 μmol/L，其余鉴定引物0.2 μmol/L。AMOS-PCR反应参数设置为：预变性95 ℃/5 min，1个循环；95 ℃/1.5 min，56 ℃/2 min，72 ℃/2 min，30个循环；72℃/5min，1个循环；4 ℃保存。取8～10 μL PCR扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳(140 V,30 min)[2，4]。

1.2.5 PFGE分型 H9812标准菌株作为分子量标记。限制性内切酶XbaI(75U)，37 ℃酶切2 h。电泳参数：电压6 V/cm，分子量50 kb～400 kb，脉冲时间2～25 s，线性转换，电场角度120°，电泳时间19 h，电泳液1×TBE，电泳液温度14 ℃。电泳结束后胶块用GelRed染料染色20 min后纯水清洗40 min后凝胶成像仪拍照(曝光时间3.0 s，去过饱和成像)。BioNumerics6.0软件对电泳图谱进行数据分析，绘制聚类分析树状图。聚类算法为非加权配对平均法(UPGMA)，电泳条带位置优化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%认定为同一PFGE带型[5]。

2 结 果

2.1 疑似布鲁氏菌感染病人血液经双相血培养、形态学与生化鉴定，AMOS-PCR检测最终确认布鲁氏菌20株，其中羊种布鲁氏菌19株，牛种布鲁氏菌1株。特别值得注意的是我们从同一患者体内分离出牛种和羊种两株布鲁氏菌。(图1)。

M：DNA marker 100 ladder；1：牛种布鲁氏菌；2-16：羊种布鲁氏菌

M：DNA marker 100 ladder；1：B.melitensis；2-16：B.bovis.

图1 布鲁氏菌AMOS-PCR电泳图谱

Fig.1 AMOS-PCR products ofBrucellaspp.

2.2 PFGE分子分型结果 20株布鲁氏菌经XbaI酶切后进行PFGE分型，20株菌分为羊种、牛种两大族群共9种不同带型(Dice, position tolence1.5%) ，各带型包含菌株数为1～7株不等。其中5种带型包含菌株数>2株，其余4种带型只包含一株菌。羊种族群19株菌又被分为两大带型(相似度>85%);牛种族群1株菌被单独划归为一种带型，与羊种菌株存在显著差异(相似度<40%)。(图2)。

3 讨 论

河南省在历史上一直是以羊种布氏菌为主的农区型布鲁氏菌病重点疫区，全省布病疫区县多达76个。虽然上世纪80年代布病疫情得到了有效控制，但自2000年以后，河南省同我国其他传统疫区一样，布病疫情出现了快速回升和强势反弹的势头，防控形势严峻。长期以来，受制于历史原因和现实客观条件的限制，疾控部门对于布病的诊断与监测一直停留在以试管凝集试验(SAT)为代表的免疫学检测和以流行病学调查为主的层面上，缺乏对布鲁氏菌病原学研究的本底资料。因此，开展布鲁氏菌的分离、鉴定及分子分型，掌握其种属构成、变异变迁和分子流行病学特征，为布鲁氏菌病的监测、暴发预警、调查、溯源提供基线与参考数据就显得尤为重要。从本研究的20株布鲁氏菌鉴定结果来看，河南省布病病人感染仍然以羊种布鲁氏菌为主，这和历史研究文献结论是相吻合的。同时我们也发现，在个体病人中也存在牛种布鲁氏菌感染及牛种、羊种并行感染的情况，值得我们认真和深入研究。

图2 羊种与牛种布鲁氏菌PFGE电泳及聚类分析图谱Fig.2 PFGE cluster analysis of B. melitensis and B. bovis

脉冲场凝胶电泳技术作为近年来细菌性传染病分子流行病学研究的工具，越来越受到重视并得以推广应用[3]。它和MLVA、MLST等分子分型技术一起在布鲁氏菌病的监测、早期预测预警，暴发疫情与突发公共卫生事件调查处置等方面发挥着重要的作用[6-7]。本研究利用该技术分析了我省病人中20株羊种与牛种布鲁氏菌PFGE“指纹图谱”特征，从染色体DNA限制性位点多态性角度验证了羊种与牛种两种生物型别间的巨大差异，为布鲁氏菌病原学研究积累了分子基线数据。从带型分布看，19株羊种布鲁氏菌最显著的特点就是分为两种带型，带型内呈现出相当高的相似度(大多数带型间的相似度>95%)，从溯源和多态性角度看需做进一步分析和验证，掌握布鲁氏菌种与亚种在不同酶切和电泳条件下的带型特征，如优势带型与暴发带型间的差异等，同时结合病人临床信息，综合应用病原学和流行病学研究方法对聚类分析图谱进行合理的解读和判定。

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[2]Romero C, Gamazo C, Pardo M, et al. Specific detection ofBrucellaDNA by PCR[J]. Clin Microbiol, 1995, 33: 615-617.

[3]Cui BY, Yin JM, Li LY, et al. Typing of Brucella isolates by repetitive element sequence-based polymerase chain reaction[J]. Dis Surveill, 2005, 20(8): 397-400. (in Chinese) 崔步云, 尹继明, 李兰玉, 等. 布鲁氏菌的Rep-PCR分型研究[J]. 疾病监测, 2005, 20(8): 397-400.

[4]Jiang H, Cui BY, Zhao HY, et al. Use of AMOS-PCR assay for the species identification ofBrucella[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(02): 107-109. (in Chinese) 姜海, 崔步云, 赵鸿雁, 等. AMOS-PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用[J]. 中国人兽共患病学报, 2009, 25(02): 107-109.

[5]Cui BY. Typing ofBrucellaby pulsed field gel electrophoresis[D]. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2006，21-36. (in Chinese) 崔步云. 布鲁菌脉冲场凝胶电泳分型研究[D]. 太原：山西医科大学系, 2006，21-36.

[6]Lopez Goni I, Garcia Yoldi D, Marin CM, et al. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce ladder) for molecular typing of all Brucella species, including the vaccine strains[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(10): 3484-3487.

[7]Baily GG, Kranhn JB, Drasar BS, et al. Detection ofBrucellamelitensisandBrucellaabortusby DNA amplification[J]. Trop Med Hyg, 1992, 95: 271-275.

Identification and PFGE molecular typing ofBrucellastrains in Henan Province, China

ZHAO Jia-yong,SU Jia,ZHANG Bai-fan,XIA Sheng-li,MU Yu-jiao,LU Jia-rui,HUANG Xue-yong

(InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China)

The aim was to detect and analyzeBrucellastrains isolated from patients in Henan Province from 2010 to 2012 with AMOS-PCR amplification and pulsed field gel electrophoresis technology, provide baseline for the monitoring, early warning, outbreak investigation, and tracing of brucellosis. We collected SAT tested positive patients blood and cultured with double phase blood bottle for at least 20 days. AMOS-PCR identification of 4 species ofBrucellatype was conducted using DNA template with thermal decomposition method after morphological and biochemical identification. The pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was made for getting the molecular type characters ofBrucellastains. Results showed that 20 strains ofBrucellawere identified by morphological, biochemical and AMOS-PCR technology, in which 19 strains were sheep species, 1 strain was cattle species.Brucellastrains were digested with XbaI and made pulsed field gel electrophoresis. The result indicated that the similarity coefficient among the 19 sheep species isolates was from 80% to 100% with 9 belt types, which had a great difference from cattle species. The sheep speciesBrucellais the main type in patients in Henan Province. AMOS-PCR and PFGE technology provide a strong tool for the brucellosis monitoring and emergency detection.

Brucella; AMOS- PCR; PFGE

Xia Sheng-li, Email: xiasl@hncdc.com.cn

“十二五”国家科技重大专项(No.2012ZX10004201和No.2012ZX10004203)联合资助

夏胜利，Email：xiasl@hncdc.com.cn

河南省疾病预防控制中心，郑州 450016

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.015

R378

A

1002-2694(2015)11-1058-03

2015-04-17；

2015-08-16

Supported by the National Science and Technology Major Project (Nos. 2012ZX10004201& 2012ZX10004203)