岗梅根水煎液对束缚应激条件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代谢的作用

胡向阳，林春淑，李安，杨璇

·药理毒理·

岗梅根水煎液对束缚应激条件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代谢的作用

胡向阳，林春淑，李安，杨璇

目的：观察岗梅根水煎液对束缚应激条件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代谢的影响。方法：将48只Wistar雄性大鼠随机分为4组:正常对照组、模型对照组、辛伐他汀组、岗梅根水煎液组，建立高脂饮食性脂肪肝模型，并给予束缚应激负荷。采用酶比色法测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C；气相色谱-质谱法测定血清TFA、SFA、UFA、MUFA、PUFA；RT-PCR检测肝脏L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表达。结果：与正常对照组比较，模型对照组TC、TG、LDL-C、肝脏指数、SFA、ACC-1mRNA表达量均显著升高(P＜0.01），HDL-C、TFA、UFA、MUFA、PUFA、L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表达量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05）。与模型对照组比较, 岗梅根水煎液组和辛伐他汀组TC、TG、LDL-C、肝脏指数、SFA、ACC-1mRNA表达量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05），HDL-C、TFA、L-FABPαmRNA、CPT-1mRNA表达量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05）。与辛伐他汀组比较，岗梅根水煎液组TC、MUFA含量CPT-1mRNA表达量升高(P＜0.05)，SFA含量、ACC-1mRNA表达量降低(P＜0.05)。结论：岗梅根水煎液对束缚应激条件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代谢有干预作用。

岗梅根；束缚应激；脂肪肝；脂肪酸代谢

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种遗传-环境-代谢应激相关性疾病，研究认为高脂饮食和情绪应激在发病中起重要作用。当前，随着我国经济社会的变革，人们生产活动趋向于自动化、信息化，导致体力劳动减少，生活节奏加快，心理应激事件增加，加上熬夜、高脂饮食、久坐等不良习惯，NAFLD的患病率和检出率逐渐升高，并趋向低龄化，已经成为危害人类健康的常见慢性疾病之一[1～2]。寻求防治NAFLD的有效方法是当前研究的热点。中医学认为，多食膏脂之人易于肥胖，情志抑郁引起“肝郁”，脂肪肝的发病多因嗜食肥甘厚味，体丰痰盛，或情志失常，忧思郁怒伤肝，致使“痰浊瘀毒”郁结于肝脏。基于中医对NAFLD的理论认识，清热解毒类中药是重要的探索方向。岗梅根是冬青科植物梅叶冬青[Ilex asprella (Hook.f. Et Arn. )Champ.ex Benth]的根，其味苦性寒，具有清热解毒、生津活血之功效。岗梅根为岭南地区的道地药材，是王老吉凉茶、沙溪凉茶等广式凉茶的主要原料。现代药理研究表明，岗梅根具有抗炎、抗病毒、抗菌和抗应激等作用[3～4]。本研究拟在脂肪肝中医理论认识基础上，遵行传统的水煎液用药方式，观察岗梅根水煎液对束缚应激条件下非酒精性脂肪肝大鼠脂肪酸代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，SPF 级，雄性，体重200±20g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：粤检证字2010B309，室温适应性饲养1周后用于本实验。

1.2 实验药物

辛伐他汀(商品名:舒降之)，杭州默沙东制药有限公司生产，批准文号H19990366，20 mg/片，产品批次：105664，临用前以生理盐水溶解浓度为1 mg．mL-1。岗梅根饮片由广东省中医院提供，水煎液制备：岗梅根5.0 kg，以每克生药加水6 mL，冷水浸泡40 min后，开始武火煎煮，煮沸后用文火慢煎30 min，趁热过滤。煎煮第二遍按每克生药加水4 mL，煎法同上，合并滤液。60℃恒温下旋转蒸发浓缩，浓缩为含生药3.14 g．mL-1的水煎液，置4℃冰箱保存备用。

1.3 试剂与仪器

胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶（广州天马精细化工厂）。胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)(南京建成生物试剂公司)。Trizol(鹏程生物

技术有限公司)，RT-PCR试剂盒{北京鼎国生物技术有限责任公司）。DY89-I型电动玻璃匀浆机(宁波新芝)，722S可见分光光度计(上海精密科学仪器有限责任公司)，AU600型全自动生化分析仪(日本OLYMPUS)，HP6890N-5973安捷伦气-质联用仪（美国惠普公司），SmartSpecTM Plus核酸蛋白检测仪(BIO-RAD)。

1.4 动物分组

Wistar大鼠48只，数字随机分组法分为4组，即正常对照组、模型对照组、辛伐他汀组、岗梅根水煎液组。

1.5 动物模型制备

各模型组分别给予高脂饮食(3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料)；正常对照组给予普通饮食。在此基础上，岗梅根水煎液组灌服剂量为 9.15 g．kg-1d-1，辛伐他汀组灌服剂量为10 mg．kg-1d-1；对照组和模型组给予等体积的生理盐水。参照文献[5]方法，除正常对照组外，其余各组大鼠在给药后2 h，放进大鼠束缚装置，束缚应激负荷8 h．d-1，束缚应激期间大鼠禁食禁水。连续8周。

1.6 指标检测

从造模开始算，第8周末当晚大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉，打开腹腔，采用真空采血管腹主动脉取血，血样4℃静置2 h后，3000 rmp离心10 min，分离血清，分装EP管，-80℃保存。游离并提取肝脏，4℃生理盐水冲洗，去除薄膜，称肝湿重，用以计算肝指数，肝指数（%）=肝湿重/体重× 100%。冰盘上剪取一小块肝叶，剪碎，移入玻璃匀浆器，加入预冷的生理盐水，用玻璃匀浆器仔细研磨，制备10%肝组织匀浆，3500 r．min-1离心10 min，取上清液，-20℃保存备用。

采用酶比色法在全自动生化分析仪测定TC、TG、HDL-C、LDL-C，操作步骤按照试剂盒说明书进行。气相色谱-质谱(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)法测定了血清总脂肪酸(Totalfatty acid,TFA）、饱和脂肪酸（Saturated fatty acid,SFA）、不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acid,UFA)、单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的含量。Primer premier5软件进行肝脏型脂肪酸结合蛋白(Liver fatty acid binding protein,LFABP)、肉碱棕搁酞转移酶-l(Camitine palmitoy l transferasel,CPT-1)和乙酰辅酶A羧化酶-1(Acety l-CoA carboxylase,ACC-1)基因引物设计，序列L-FABP：F:5'-CTCATTGCCACCATGAACTTCTC-3'，R:5'-AGCC-TTGTCTAAATTCTCTTGCTGACT-3'；CPT-1:F:5'-TCCATGCATACC-AAAGTG-GA-3'，R:5'-TCATCAGTGGCCTCACAGAC-3'；ACC-1：F:5'-AGG ACT TCATGA- ATTTGC TG-3'，R:5'-GTCATCACCATCTTCATTACCTCA-3'。合成由上海生工生物工程技术公司完成，用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测肝脏L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表达。

1.7 统计学处理

使用SPSS14.0统计软件对数据进行重复测量资料的方差分析，定量指标以 (±S)表示，方差分析，组间两两比较采用q检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清血脂及肝指数情况变化

与正常对照组比较，各组大鼠血清T C、TG、LDL-C含量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05）；模型对照组HDL-C含量降低（P＜0.05），肝指数升高（P＜0.05）。与模型对照组比较, 辛伐他汀组、岗梅根水煎液组TC、TG、LDL-C含量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05)，HDL-C含量升高(P＜0.05)。与辛伐他汀组比较, 岗梅根水煎液组TC含量升高(P＜0.05)。（见表1）。

表1 各组大鼠血脂情况比较 (n =12，±S )

表1 各组大鼠血脂情况比较 (n =12，±S )

注：与正常对照组比较，1)P＜0.01,2)P＜0.05；与模型对照组比较，3)P＜0.01,4)P＜0.05；与辛伐他汀组比较，5)P＜0.05

TC (mmol．L-1)组别 TG (mmol．L-1) HDL-C (mmol．L-1) LDL-C (mmol．L-1)肝指数(%)正常对照组 0.54±0.11 2.41±0.13 1.34±0.10 0.42±0.01 2.53±0.11模型对照组 2.36±0.211)17.25±2.121)0.48±0.021)5.26±0.121)3.49±0.322)辛伐他汀组 0.62±0.023)6.33±0.521,3)0.71±0.012,4)1.35±0.111,3)2.70±0.13岗梅根水煎液组 0.73±0.103)8.17±1.121,3,5)1.02±0.113)1.13±0.131,3)2.62±0.22

2.2 各组大鼠血清各类脂肪酸含量的变化

与正常对照组比较，模型对照组TFA、UFA、MUFA和PUFA含量均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05），SFA含量升高(P＜0.01）。与模型对照组比较，岗梅根水煎液组TFA含量升高(P＜0.05），SFA含量降低(P＜0.01）；辛伐他汀组TFA含量升高(P＜0.05）。与辛伐他汀组比较，岗梅根水煎液组SFA含量降低(P＜0.05），MUFA含量升高(P＜0.05）。（见表2）。

表2 各组大鼠血清血清各类脂肪酸含量比较 (n =12,±S, μg．mg-1)

表2 各组大鼠血清血清各类脂肪酸含量比较 (n =12,±S, μg．mg-1)

注：与正常对照组比较，1)P＜0.01,2)P＜0.05；与模型对照组比较，3)P＜0.01,4)P＜0.05；与辛伐他汀组比较，5)P＜0.05

组 别 TFA SFA UFA MUFA PUFA正常对照组 146.37±11.15 46.22±12.30 103.60±12.16 64.31±7.12 35.28±4.13模型对照组 72.33±9.261)78.40±5.321)70.32±6.211)40.71±5.131)21.22±3.152)辛伐他汀组 106.27±10.212,4)63.21±7.151)75.22±6.371)37.22±4.121)27.48±4.362)岗梅根水煎液组 115.20±10.532,4)51.04±4.913,5)83.46±7.222)57.30±5.262,5)25.31±4.502)

2.3 各组大鼠脂肪酸代谢相关基因检测结果

与正常对照组比较，模型对照组L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表达量均显著降低(P＜0.01），ACC-1mRNA表达量显著升高(P＜0.01）。与模型对照组比较, 岗梅根水煎液组和辛伐他汀组L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA表达量均有不同程度的升高(P＜0.01或P＜0.05），ACC-1mRNA均有不同程度的降低(P＜0.01或P＜0.05）。与辛伐他汀组比较, 岗梅根水煎液组CPT-1mRNA表达量升高(P＜0.05)，ACC-1mRNA表达量降低(P＜0.05)（见表3）。

表3 各组L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表达量比较 (±S)

表3 各组L-FABPmRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA的表达量比较 (±S)

注：与正常对照组比较，1)P＜0．01，2)P＜0．05；与模型对照组比较，3)P＜0．01，4)P＜0．05；与辛伐他汀组比较，5)P＜0．05

组 别 n L-FABPmRNACPT-1mRNAACC-1mRNA正常对照组 12 0.71±0.03 1.37±0.12 0.43±0.01模型对照组 12 0.35±0.011)0.83±0.111)1.26±0.131)辛伐他汀组 12 0.52±0.022,4)0.90±0.131)0.72±0.111,4)岗梅根水煎液组 12 0.60±0.023)1.15±0.103,5)0.51±0.103,5)

3 讨论

本实验采用高脂饮食法建立大鼠NAFLD模型，在发病机制上与现阶段人类NAFLD较为接近，简便易行，重复性好，脂肪肝的复制率高。同时，为了观察饮食、情绪、运动等复合因素对机体血脂代谢的影响，本实验在高脂饮食基础上，给予大鼠进行慢性束缚应激刺激。以剥夺身体自由活动、束缚制动刺激为应激原造成的应激称为束缚应激，是目前实验医学领域最普遍应用的应激原。既往研究表明大鼠动物躯体活动受限后，短期产生愤怒、挣扎、焦虑不安、烦躁等心理以及行为变化，长期束缚大鼠出现抑郁、失眠等心理及行为学表现[6]。慢性束缚应激与人类精神应激下的心理行为学演变过程接近。肝脏是内源性血脂和脂蛋白合成及代谢的主要器官，膳食中的脂质主要是TG、TC，它们通过胰脂肪酶、胆固醇酯酶等水解为游离胆固醇和脂肪酸。采用高脂肪饮食诱导脂肪肝模型，进入肝脏的脂肪量超过肝脏的脂质和氧化能力，导致肝脏脂质代谢发生障碍，肝内脂质类物质合成与分泌的动态平衡失调，合成的内源性TG就不能以脂蛋白的形式进出肝脏，在肝细胞内、外堆积形成脂肪肝，高脂饮食持续存在时可进展为脂肪性肝炎[7～8]。

NAFLD的发病率逐年升高，但其发病机制仍不十分清楚。Day提出的“二次打击”学说逐渐被多数学者所接受，这两个过程中脂肪酸代谢平衡的改变贯穿于始终[9]。L-FABP是脂肪酸结合蛋白家族中的一种，L-FABP主要参与长链脂肪酸的弥散、吸收、代谢和转运，将脂肪酸从脂膜运输到脂肪酸氧化位置，脂化成甘油三酯并进入细胞核发挥调控功能。在肝细胞、脂肪细胞中，脂肪酸是脂质生物合成、储存或降解过程的主要底物[10]。CPT-l是脂肪酸氧化过程的关键限速酶，位于线粒体外膜上，催化长链脂酞CoA与肉碱形成脂酞肉碱，CPT-l的表达水平升高有助于增加脂肪酸分解，降低体脂肪沉积量[11]。ACC1可催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰辅酶A，该羧化作用是长链脂肪酸的生物合成中的限速反应。ACC1催化的反应产物丙二酸单酰辅酶A，是脂肪酸合成和代谢过程中重要的中间代谢物，能够降低脂肪酸的氧化水平，促进脂质生成[12]。

本实验选用辛伐他汀作为对照药物，辛伐他汀是临床上应用广泛的调脂药，研究发现其还具有抗炎、免疫调节作用、改善血管内皮功能、稳定和逆转粥样硬化斑块等作用[13]。本实验研究发现，应激+

高脂饮食促进大鼠脂肪肝的形成，岗梅根水煎液通过L-FABPα mRNA、CPT-1mRNA和ACC-1mRNA等脂肪酸代谢基因途径对模型大鼠脂肪酸代谢发挥调控作用。岗梅根水煎液的上述药理效应与其“清热解毒、生津活血”功效相关，契合中医对脂肪肝的嗜食肥甘厚味，忧思郁怒伤肝，“痰、浊、瘀、毒”郁结于肝脏的病因病机认识，但其作用或调控机制需要进一步理论挖掘及实验研究。

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（责任编辑：陈思敏）

R 285.5

A

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中山大学附属第五医院青年医师科研基金（编号：201208 ）

中山大学附属第五医院中西医结合科，广东 珠海519000

胡向阳（1975-），男，博士，副主任医师，主要从事代谢性疾病研究

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2014-06-29