鼻炎通窍喷雾剂对变应性鼻炎豚鼠血清IL-4含量和鼻黏膜Bax蛋白表达的影响

马藏，李涓，干小红，周后凤

·药理毒理·

鼻炎通窍喷雾剂对变应性鼻炎豚鼠血清IL-4含量和鼻黏膜Bax蛋白表达的影响

马藏1，李涓2，干小红1，周后凤1

目的：通过研究鼻炎通窍喷雾剂对变应性鼻炎（Allergic rhinitis,AR）模型豚鼠血清中白细胞介素4（Interleukin-4,IL-4）含量和鼻黏膜组织中Bax蛋白表达的影响，探讨鼻炎通窍喷雾剂治疗变应性鼻炎的作用机制。方法：用10%甲苯-2,4二异氰酸酯（10%toluene-2,4-diisocyanate ,TDI）橄榄油溶液建立豚鼠变应性鼻炎模型；用酶联免疫吸附法（ELISA）定量测定各组豚鼠血清中IL-4的含量，免疫组化法测定鼻黏膜组织中Bax蛋白的表达。结果：实验组豚鼠血清的IL-4表达水平显著低于模型对照组（p＜0.01）；实验组豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白的表达水平显著高于模型对照组 (P＜0.01)。结论：鼻炎通窍喷雾剂对变应性鼻炎的作用机制与调节免疫功能、促进炎细胞凋亡有关。

鼻炎通窍喷雾剂 ；变应性鼻炎；白细胞介素4；Bax

鼻炎通窍喷雾剂是我院自行研制的纯中药制剂，临床治疗变应性鼻炎疗效确切。本研究通过建立AR豚鼠模型，观察鼻炎通窍喷雾剂对血清中IL-4的含量和鼻粘膜中Bax阳性表达的影响，进一步探讨该药治疗AR的部分作用机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料

1.1 实验药物

受试药物：鼻炎通窍喷雾剂，由成都中医药大学附属医院药剂科提供，1.6 g生药/mL，临床拟用剂量为成人每日约1.158 g生药。批号100601。

阳性对照药：曲安奈德鼻喷雾剂，6 mL/瓶，1.1 mg．mL-1，昆明源瑞制药有限公司提供，批号：101213，批准文号：国药准字20010190。

1.2 实验动物

健康豚鼠一批，雌雄各半，体重250～300 g，四川省实验动物专委会养殖场提供，生产许可证号：SCXK(川)2008-14。

1.3 实验试剂

甲苯-2，4二异氰酸酯(TDI) 上海试剂一厂，批号20111001；橄榄油（中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20110202）；IL-4 Elisa试剂盒，由成

都宝信生物有限公司提供，批号为201110；自制FAA固定液；Bax一抗（Rabbit Anti-BAX），货号BA0315，购自博士德生物技术有限公司；Bax二抗及相应试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

1.4 实验仪器

SARTORIUS电子分析天平，d=0.1～0.01 mg，德国。T-l000型电子天平，d=0.1 g，美国双杰兄弟(集团)有限公司；百乐550型酶标仪；Thermo legend TR+离心机；Thermo WELLWASH 4 MK 洗板机；5-100 μL 芬兰加样枪；BX50光学显微镜，日本Olympus公司出品。Mias-2000图形分析系统。微量加样器，上海医用激光仪器厂。

2 方法

2.1 实验方法

2.1.1 造模方法 取健康豚鼠一批，雌雄各半，按性别随机抽取10只作为正常对照组，剩余的豚鼠作为模型组用来造模。模型组动物参照Tanaka[1]及赵秀杰[2]等关于鼻超敏反应模型的制作方法进行造模。模型组动物用微量加样器自豚鼠双侧鼻孔滴入10%TDI橄榄油溶液，每侧5 μL，每日1次，连续7天。通过行为学评分判断模型是否成功。7天后改为隔日1次（于给生理盐水或治疗药物之后15分钟给予橄榄油或TDI[3]），维持致敏状态，直到药物治疗结束。正常对照组动物同法给予橄榄油。

2.1.2 分组与给药方法 于给造模药的第8天从模型组抽取30只（雌雄各半）造模成功的豚鼠，按性别和体重随机分成3组，每组10只，分别是模型对照组、鼻炎通窍喷雾剂组、曲安奈德鼻喷雾剂组。同时各组分别按照表1所示的剂量和方法给予药物或溶剂，每天1次，连续用药14天。

表1 鼻炎通窍喷雾剂治疗AR豚鼠的给药剂量表

2.1.3 标本采集与测定方法 最后一次给药后2小时，股动脉取血5 mL，室温下血液自然凝固15分钟，2500转/分离心20分钟 ，收集上清液，将血清置-80℃冰箱备ELISA法测定血清中IL-4的含量，具体操作方法严格按使用说明书进行。采血后处死动物，剥离鼻周围皮肤，包括上腭骨皮肤，沿鼻中线切开，暴露鼻中隔与双侧鼻腔，剪下鼻中隔黏膜，用FAA液固定，做免疫组化染色，具体方法是：取鼻中隔黏膜常规石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。10%的正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加稀释的一抗(稀释倍数1:100)， 4℃过夜。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，复染，封片。在10×20倍光镜下每组每只动物都选取5个Bax蛋白阳性表达视野（Bax蛋白阳性免疫组化染色为棕黄色），运用Mias-2000图形分析系统(四川大学图像图形研究所)对Bax蛋白在选定视野的鼻黏膜固有层中所占的面积总和比、积分光密度总和比进行分析，定量测定Bax蛋白在鼻粘膜中的表达。

2.2 统计方法

数据处理采用SPSS19.0统计软件，数据记录采用均数±标准差（±S），组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 对AR模型豚鼠血清IL-4的影响

结果如表2所示：与正常对照组比较，模型对照组豚鼠血清IL-4含量显著升高（p＜0.01）。与模型对照组相比，鼻炎通窍喷雾剂组豚鼠血清IL-4的含量显著降低（p＜0.01）。

表2 鼻炎通窍喷雾剂对AR豚鼠血清IL-4含量的影响（±S）

表2 鼻炎通窍喷雾剂对AR豚鼠血清IL-4含量的影响（±S）

注：与模型对照组比较， ** p＜0.01

组别 例数（n） 血清IL-4的含量（ ng．L-1）正常对照组 10 24.07±2.96**模型对照组 10 35.24±6.05鼻炎通窍喷雾剂组 10 28.97±4.14**曲安奈德喷雾剂组 10 25.94±3.16**

3.2 对Bax蛋白的影响

结果见图1-4及表3：与正常对照组相比，模型对照组豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白阳性物质面积总和比、积分光密度总和比显著降低(P＜0.01)。与模型对照组相比，鼻炎通窍喷雾剂组豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白阳性物的面积总和比、积分光密度总和比显著升高 (P＜0.01)。提示鼻炎通窍喷雾剂可以增加变应性鼻炎模型豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白的表达，从而促进炎细胞

的凋亡。

表3 鼻炎通窍喷雾剂对AR豚鼠鼻黏膜Bax蛋白表达的影(±S)

表3 鼻炎通窍喷雾剂对AR豚鼠鼻黏膜Bax蛋白表达的影(±S)

注：与模型对照组比较，** p＜0.01

组别 例数（n） 面积﹪ 积分光密度﹪正常对照组 10 23.63±2.1**32.35±2.77**模型对照组 10 9.89±4.1 13.7±5.02鼻炎通窍喷雾剂组 10 15.19±2.62**19.89±3.3**曲安奈德喷雾剂组 10 21.94±3.26**26.39±2.22**

图1 正常对照组Bax成强阳性表达

图2 模型对照组Bax成微弱表达

图3 鼻炎通窍喷雾剂组Bax成弱阳性表达

图4 曲安奈德喷雾剂组Bax成阳性表达

4 讨论

大量研究表明变应性鼻炎是1型辅助性T细胞（Thl）和2型辅助性T细胞（Th2）细胞之间免疫反应失衡，以鼻腔黏膜Th2免疫反应为主的变应性炎症反应，其主要的免疫病理学特征是组织中大量表达Th2细胞因子的细胞浸润[4～6]。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13等Th2细胞因子，参与体液免疫，引起速发型(I型)变态反应。其中IL-4是导致过敏性炎症发生的关键性细胞因子,它除了能使未受抗原刺激的成熟辅助性T细胞(Th0)分化为Th2外, 还促使B细胞转化为浆细胞，促使肥大细胞成熟脱颗粒，释放炎性介质。IL-4作为迟发相的始动因素，引发Th2型细胞持续释放IL-4，并促使炎症细胞的聚集和活化。故IL-4在变应性鼻炎疾病过程中起重要作用。如冯纬纭等[7]研究发现常年性变态反应性鼻炎患者血清IL-4，S-IgE水平明显高于健康组，说明AR发作时存在着T辅助细胞亚群功能失调，通过释放细胞因子，促进S-IgE的合成与分泌，并增加炎性细胞的浸润和活化，从而导致了I型变态反应疾病AR的发生。袁颖等[8]通过动物实验研究发现OVA致敏模型组大鼠血清IL-4含量升高，经鼻炎喷剂治疗的大鼠其血清IL-4含量降低。表明，鼻炎喷剂治疗变应性鼻炎可能是通过调节细胞因子平衡，抑制Th2类细胞因子的分泌，从而减轻变态反应性炎症。

本实验研究表明，鼻炎通窍喷雾剂能降低AR豚鼠血清中IL-4含量，提示鼻炎通窍喷雾剂具有抑制Th2细胞亚群优势反应的作用，其可能的作用机制为：抑制Th2细胞的分泌功能，降低IL-4的含量，调节免疫功能，恢复Th1和Th2之间的平衡，抑制IgE的合成与分泌，减少炎性介质的释放，从而缓解AR的症状。与文献报道相一致。

凋亡是炎细胞转归的常见形式，凋亡能形成凋亡小体，被周围的细胞吞噬，溶酶体保持完整，酶不外溢，不会造成炎症反应[9]。Bax被认为是促进细胞凋亡最重要的调控基因。Dewson等[10]研究发现新鲜分离的嗜酸粒细胞胞质和胞核中有活化的Bax表达，嗜酸粒细胞凋亡过程中Bax解聚并从胞质或胞核中移至线粒体，线粒体便释放细胞色素C，扰乱线粒体膜电位，从而激活天冬氨酸一特异半胱氨酸蛋白激酶(caspase)，促使嗜酸性粒细胞（EOS）凋亡。还有研究表明EOS凋亡增加可减少浸润的EOS的数量[11]。因此，能否诱导细胞凋亡在治疗各种炎症性疾病中有重要意义。本实验结果显示：正常对照组豚鼠鼻黏膜中见较多Bax阳性表达细胞，表现为不均匀的黄褐色颗粒状物。模型对照组豚鼠鼻中隔黏膜中胞浆表达Bax的细胞比例显著低于正常对照组，表现为较浅的黄褐色颗粒状物(P＜0.01)。与模型对照组比较，鼻炎通窍喷雾剂组鼻中隔黏膜中胞浆阳性细胞的比例显著升高(P＜0.01)。表明鼻炎通窍喷雾剂能增加鼻黏膜组织中Bax的含量，促进炎细胞的凋亡，减轻局部炎症侵润，缓解AR症状。

总之，通过本实验研究我们可以认为，降低血清中IL-4的含量、促进鼻粘膜中Bax蛋白的表达，从而恢复正常的免疫功能、促进炎细胞的凋亡、减少炎细胞侵润，是鼻炎通窍喷雾剂治疗变应性鼻炎的作用机制之一。

[1] Tanaka K,Okamoto Y,Nagaya Y,et a1.S nasal allergy model developed in the Guinea pig by intranasal application of 2,4-toluene diisocyanate[J].Int Archs Allegy Appl Immunol,1998,85:392.

[2] 赵秀杰,董震,杨占泉,等.鼻超敏反应实验模型的建立[J].中华耳鼻咽喉科杂志,1993,28(1):17.[3] 张琼,董倩倩,陈立峰,等.碧云喷雾剂对豚鼠TDI变应性鼻炎的作用研究[J].湖南中医学院学报,2006,26(3):27.

[4] AB,Kay,Allergy and allergic diseases:first of two parts[J].N Engl J Med,2001,344:30.

[5] RM,Varney VA, Jacobson MR, Sudderick.Immunohistology of the nasalmucosa following allergen-induced rhinitis. Identification of activated Tlymphocytes,eosinophils,and neutrophils[J].Am Rev Respir Dis,1992,146,170.

[6] S,Robinson DS,Hamid G,Ying Predominant TH2-1ike bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma[J]. N Engl J Med,1992,326,298.

[7] 冯纬纭,张勉,方燕飞,等.过敏性鼻炎口服液对常年性变态反应性鼻炎S-IgE及IL-4的影响[J].时珍国医国药,2005,16(12):1232.

[8] 袁颖,郭忻. 鼻炎喷剂对变应性鼻炎大鼠细胞因子IL-4、IFN-γ的影响[J].江苏中医药,2008,40(6):78.

[9] 来茂德主编.医学分子生物学[M].北京:人民卫生出版社, 1999:76.

[10] Dewson G,Cohen GM,Wardlaw AJ.Interleukin一5 inhibits translocation of Bax to the mitochondria,cytochrome C release,and activation of caspases in human eosinophils[J]. Blood, 2001,98(7):2239.

[11] Kankaanran ta H,Lindsay M A,Giembycz M A et al. Delayed eosinophile apoptosis in asthm[J].J Allergy Clin Immunol,2000,106(1):77.

（责任编辑：陈思敏）

Effects of Biyan Tongqiao spray on the content of IL-4 in blood serum and expression of Bax in nasal mucosa of guinea pig model with allergic rhinitis/

MA Cang1,LI Juan2,GAN Xiao-hong1,ZHOU Hou-feng1//(1.Chengdu Fifth People's Hospital, Chengdu 611130, Sichuan;2.Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan)

Objective:To observe the effect of the Biyan Tongqiao spray on the content of IL-4 in blood serum and expression of Bax in nasal mucosa of guinea pig model with allergic rhinitis (AR) and explore the mechanism of Biyan Tongqiao spray in treating AR.Method:Guinea pig model with AR was established by using 10% toluene-2,4-diisocyanate olive oil solution. The content of IL-4 in blood serum was detected by ELISA method and expression of Bax in nasal mucosa was detected by immunohistochemical method.Result:The level of IL-4 in blood serum was markedly lower in the experimental group than in the model group (P＜0.01). The level of Bax protein in nasal mucosa was markedly higher in the experimental group than in the model group (P＜0.01).Conclusion:The mechanisms of Biyan Tongqiao spray in treating AR may be related to its effects of modulating immune function and promoting the apoptosis of infammatory cell.

Biyan Tongqiao spray; allergic rhinitis; IL-4; Bax

R 285.5

A

1674-926X(2015)02-017-03

成都中医药大学科技发展基金

1.成都市第五人民医院，四川 成都 611130；

2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072

马藏（1984-），女，汉族，药师，硕士研究生，主要从事药理学研究

Email:249139059@qq.com

李涓（1963-），女，汉族，主任药师，主要从事中药药理及毒理学研究

Email:li062@126.com

2014-09-12