长期递增负荷运动对胸腺细胞凋亡及其细胞周期调控蛋白的影响

张馨蕾，郝选明，阮 洋，覃 飞



长期递增负荷运动对胸腺细胞凋亡及其细胞周期调控蛋白的影响

张馨蕾1，郝选明2，阮 洋3，覃 飞2

目的：观察6周递增负荷运动过程中，大鼠胸腺结构、胸腺细胞凋亡蛋白、胸腺细胞周期调控蛋白的变化特征。方法：雄性SD大鼠80只随机分为安静组和运动组，运动组进行6周递增负荷跑台运动，分别于第0、2、4、6周运动完成后通过HE染色观察大鼠胸腺组织形态，通过免疫组织化学技术测定胸腺细胞凋亡蛋白bax、bcl-2及细胞周期蛋白cyclinE、cyclinB1与细胞周期抑制蛋白p21的表达。结果：1)大鼠胸腺细胞密度下降，皮、髓质融合，网状结构破坏并出现脂肪细胞及血细胞；2)与0周组相比，2周组、6周组Bax/Bcl-2比值均显著增加(P<0.01)；与2周组相比，4周组、6周组显著减少(P<0.01)；6周组较4周组显著增加(P<0.01)；3)细胞周期G1/S期调控蛋白cyclinE表达0～2周上升(P>0.05)，4周时较0、2周急剧下降(P<0.01)，6周较4周显著提高(P<0.05)；细胞周期抑制蛋白p21表现出2周时显著上升(P<0.01)，4周时下调(P>0.05)，6周略有回升(P>0.05)的变化趋势，4、6周p21表达量较2周差异非常显著(P<0.01)；G2/M期调控蛋白cyclinB1表达呈先上升后下降的变化趋势，差异不具有显著性(P>0.05)。结论：6周递增负荷运动过程中，大鼠胸腺组织结构发生渐行性破坏；Bax/Bcl-2比值呈现上升、下降再上升的变化特征，大鼠胸腺细胞凋亡增加以Bcl-2的变化为主导；大鼠胸腺细胞周期G1/S期调控蛋白较G2/M期调控蛋白受递增负荷运动影响更显著。长期递增负荷运动可能主要通过在G1/S期造成DNA复制障碍，阻滞胸腺细胞周期运转。细胞周期阻滞可能是胸腺细胞凋亡发生的原因之一。

递增负荷运动；胸腺；细胞凋亡；细胞周期

适量的运动可提高机体免疫功能，维持和促进健康。然而，剧烈运动会导致免疫系统机能下降，发生运动性免疫抑制。细胞免疫失衡是运动性免疫抑制的主要机制。已有研究表明，大强度运动可导致T细胞发育受阻[11,10]。细胞周期的正常运转是细胞增殖与分化有序进行的重要保证，细胞周期阻滞可导致细胞凋亡的发生[3,7,14,16]。因此，T细胞发育水平的变化在运动性免疫抑制的发生发展过程中发挥重要的作用。胸腺是T细胞分化发育的场所,目前关于运动对胸腺细胞周期变化的研究还鲜有报道。既往研究发现，大强度运动会刺激细胞周期调节因子，使其活性发生改变，从而阻滞细胞周期于某一时期，影响周期正常运转。然而，大强度运动如何影响胸腺细胞周期调控因子，进而如何影响胸腺这一中枢免疫器官的机能，诸多问题还有待于进一步研究。

本研究通过建立大鼠递增负荷训练模型，重点观察胸腺细胞周期G1/S期和G2/M期这两个关键调控点各调控蛋白的变化特征，并分析其相互关系，进而明晰运动性免疫抑制发生发展过程中胸腺组织结构改变和胸腺细胞凋亡信号通路相关蛋白变化的可能联系，探究大强度运动影响细胞免疫功能的机制。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象与分组

SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(8周龄，体重223.23±16.56 g，广州中医药大学实验动物中心提供，动物批号：SCXK(粤)2008-0020)共计80只，每笼5只分笼饲养，喂食国家标准颗粒型固体大鼠饲料，饮用蒸馏水，自由饮食饮水。适应性饲养1周后，随机分为安静对照组和运动组，每组40只。安静组用于判别大鼠生长发育对所测指标的影响，结果显示各周之间无显著差异，表明生长发育对所测指标无明显影响。运动组进行六周递增负荷跑台运动。

1.2 运动方案

采用6周递增负荷运动模型。大鼠进行匀速跑台运动，坡度为0，30 min/次，1次/天，6天/周。适应性运动1周，跑台速度为10 m/min，定为第0周。正式训练第1周运动负荷为10 m/min，第2周起始负荷定为20 m/min，以后每周递增负荷5 m/min，至第6周达到40 m/min，到达大鼠最大强度负荷。

1.3 主要试剂

一抗Bax、Bcl-2、cyclinB1、cylcinE、p21(北京博奥森)，羊抗兔二抗试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德)，苏木素、伊红、PBS、过氧化氢、二甲苯、各梯度乙醇、10%中性甲醛溶液、0.5%盐酸酒精溶液、枸橼酸盐缓冲液、3%H2O2溶液、中性树胶。

1.4 测试指标及方法

1.4.1 HE染色观察胸腺组织形态结构

分别于第0、2、4、6周最后一次运动完成48 h后对大鼠无菌取材胸腺组织，置于10%中性甲醛溶液固定。梯度乙醇脱水、浸蜡、包埋，4 μm厚度切片，水化，染色，透明，封片。在光学显微镜10×10、40×10倍视野下观察HE染色胸腺皮质、髓质结构变化及有无炎症渗出、出血等。

1.4.2 免疫组化检测胸腺细胞凋亡蛋白及周期蛋白表达

采用SABC法进行免疫组织化学染色，DAB显色，常规脱水、透明、封片。在光学显微镜10×10、40×10倍视野下观察免疫组织化学染色胸腺组织中Bax、Bcl-2、cyclinE、p21和cyclinB1蛋白阳性表达程度。

1.4.3 免疫组化图像处理

所采集图像用Image-Pro Plus 6.0软件进行阳性表达定量分析，得出积分光密度(IOD)、阳性表达面积(Area)，通过Density=IOD/Area得出平均光密度。每张图片选取5个视野计算平均值。

1.5 数理统计

2 实验结果

2.1 6周递增负荷运动过程中大鼠胸腺结构变化

HE染色镜下观察：0周组胸腺组织结构完整，皮髓质界限清晰，皮质细胞密集；髓质内上皮细胞连接形成的网状结构清晰，未见脂肪细胞。2周组皮质内淋巴细胞密度降低，皮髓质界限出现融合，髓质上皮细胞增多，网状结构可见，出现少量脂肪细胞。4周组髓质内出现脂肪细胞，出现细胞破裂、融合现象，网状结构不完整，并有少量血细胞出现。6周组胸腺细胞明显减少，皮髓质交叉、融合，并有明显断裂带出现，组织结构萎缩；上皮细胞散在，网状结构消失，血细胞较4周时增多。

2.2 6周递增负荷运动过程中大鼠胸腺细胞凋亡信号通路相关蛋白Bax、Bcl-2表达变化

Bax蛋白阳性表达为细胞胞浆内棕黄色颗粒。6周递增负荷运动过程中，大鼠胸腺Bax表达量的变化总体呈先显著上升后略有下降，而后趋于平稳的态势。与0周组相比，2周、4周、6周组Bax表达量均具有显著性增加(P<0.01)。4周组较2周组具有较显著减少(P<0.05)；6周组较4周组则具有显著性增加(P<0.05)。

图1 本研究大鼠胸腺结构形态变化示意图(HE,×400)

图2 本研究大鼠胸腺Bax阳性表达结果示意图(SABC,×400)

Bcl-2蛋白阳性表达为棕黄色颗粒，定位于细胞质及胞浆内。大鼠胸腺Bcl-2的表达：0～2周呈下调趋势(P<0.01)，4周较2周显著增多(P<0.01)，6周时较4周明显回落(P>0.05)。

图3 本研究大鼠胸腺Bcl-2阳性表达结果示意图(SABC,×400)

表1 本研究大鼠胸腺Bax、Bcl-2含量及Bax/Bcl-2的变化一览表

Table 1 The Variations of Bax,Bcl-2 and Bax/Bcl-2 in Rat Thymus

注：1)与Week0比较：*P<0.05,**P<0.01；与Week2比较：#P<0.05,##P<0.01; 与Week4比较：△P<0.05,△△P<0.01。2) 根据大鼠存活情况，各组样本量为Week0:n=10、Week2:n=10、Week4:n=9、Week6:n=8。下同。

大鼠胸腺Bax/Bcl-2在6周递增负荷运动过程中的变化情况总体呈上升、下降后又上升的趋势。2周组、6周组与0周组相比均具有显著性差异(P<0.01)；与2周组相比，4周组、6周组具有显著性差异(P<0.01)；6周组较4周组Bax/Bcl-2具有显著性差异(P<0.01)。

2.3 6周递增负荷运动过程中大鼠胸腺细胞周期调控蛋白变化

CyclinE阳性反应为棕黄色颗粒，定位于细胞核。6周递增负荷运动过程中，大鼠胸腺细胞cyclinE表达呈0～2周上升(P>0.05)；在第4周时表达量急剧下降，与0、2周比均具有非常显著性差异(P<0.01)；而6周cyclinE阳性表达量与4周比较显著提高(P<0.05)。

图4 本研究大鼠胸腺组织CyclinE阳性表达示意图(SABC,×400)

细胞周期抑制蛋白p21阳性表达主要分布于细胞核中，呈棕黄色颗粒。与0周相比，大鼠胸腺中的p21表现出2周时表达量显著上升(P<0.01)，4周时下调至0周水平(P>0.05)，6周略有回升的变化趋势(P>0.05)。4、6周较2周p21阳性表达量的差异非常显著(P<0.01)。

图5 本研究大鼠胸腺组织p21阳性表达示意图(SABC,×400)

CyclinB1阳性表达主要分布于细胞核中，呈棕黄色颗粒。本实验中，CyclinB1的表达随着6周递增负荷运动的进行，呈现出2周时升高，4周下降，6周再次回升的变化趋势。但变化趋势平稳，各周cyclinB1阳性表达量间均无显著性差异。

图6 本研究大鼠胸腺组织CyclinB1阳性表达示意图(SABC,×400)

WeekcyclinEp21cyclinB100.077±0.010 0.031±0.017 0.061±0.00720.093±0.0350.171±0.034**0.086±0.03840.049±0.009**##0.035±0.019##0.062±0.00860.064±0.017##△0.046±0.014##0.080±0.012

3 分析与讨论

3.1 6周递增负荷运动中胸腺形态结构的变化特征

胸腺是T细胞分化发育的场所，并能分泌胸腺素等多种细胞因子，具有重要的免疫调节功能[2]。前期研究表明，随着运动负荷的增加，大鼠胸腺指数逐渐下降，胸腺萎缩加重[11]。本实验中，对照组大鼠各周胸腺结构未见明显变化，运动组大鼠在中低强度训练时(0～2周)，大鼠胸腺组织结构清晰，皮质细胞密集，髓质内上皮细胞连结成的网状结构未遭到破坏。随着运动时间和强度的增加，2周末时胸腺小叶皮、髓质界限不清，且有脂肪细胞出现。揭示大鼠作为不惯常运动动物，其机体对运动负荷不适应而产生应激性表现。至4周时，胸腺出现少量出血现象，但组织结构较2周没有明显变化，反应机体对运动负荷逐步适应，自身调控以维持自身免疫机能平衡。至6周时运动负荷至大鼠最大承受强度，胸腺组织萎缩和受损程度明显加重，提示长时间大强度运动可造成机体已形成的免疫平衡再度被破坏，出现免疫抑制。

3.2 6周递增负荷运动中大鼠胸腺细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2的变化特征

有研究结果支持胸腺组织萎缩、胸腺细胞数量下降是由细胞凋亡导致[5,15]。细胞凋亡B细胞淋巴瘤基因(Bcl-2)和编码Bcl-2相关蛋白X基因(Bax)是细胞凋亡过程中的重要调控物质，分别在细胞凋亡的调控中起到抗凋亡和促凋亡的作用，即 Bcl-2 与 Bax 的比例与细胞凋亡成线性正相关[17,22]。针对6周递增负荷运动过程中大鼠胸腺萎缩和正常结构发生破坏的现象，本实验研究了细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2的变化。在6周递增负荷运动过程中，大鼠胸腺细胞凋亡调控蛋白随着运动负荷的逐渐增加产生波动性变化。2周时胸腺Bax较0周增加近一倍，Bcl-2减少一半，Bax/Bcl-2比值由0周的0.95增至3.35(P<0.01)。由于Bax大幅度增加，大量Bax同源二聚体生成，因此可促使淋巴细胞凋亡率上升。4周时Bax下调，Bcl-2上调显著，Bax/Bcl-2的比值达到1.04接近0周的水平。说明机体通过自我调控，对运动负荷逐步适应，免疫系统在一个更高的层面建立了新的平衡。提示机体主要是通过上调Bcl-2来对抗凋亡，在此过程中Bcl-2占主导地位。然而这种平衡只是暂时的和一过性的，随着负荷的不断增加，机体免疫平衡无法维持，再次遭到破坏，6周时Bcl-2显著性减少，Bax升高，促进细胞凋亡。提示6周递增负荷运动过程中胸腺细胞凋亡增加，胸腺萎缩可能是由淋巴细胞凋亡引起的。

3.3 6周递增负荷运动过程中胸腺细胞周期G1/S期调控因子的变化特征

细胞周期进程与细胞增殖、细胞凋亡均存在密切联系[13]。宋其蔓等[9]发现，白藜芦醇抑制系膜细胞增殖的作用是通过将系膜细胞周期阻滞于S期实现的。苑召虎等[12]发现，槲皮素可通过阻断人胶质瘤细胞的细胞周期进程来抑制其增殖。有早期研究发现细胞凋亡过程中，Bax、Bcl-2与CDK2激酶活性存在一定关系[19]。多项研究也均证实了细胞周期的阻滞是诱导细胞凋亡的因素之一[3,7,14,16]。

一个完整的细胞周期进程包括间期和分裂期(M期)两个阶段。其中间期由DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)三部分组成。细胞周期进程中有两个重要事件，即DNA的复制和DNA的分配。相应地，有两个重要的调控点，即G1/S和G2/M。细胞周期的有序运转是细胞正常发育的重要保障，其有序运转受到一系列调控因子的严密调控。[1,8,21]

CyclinE是细胞周期G1/S限制点的重要调控蛋白，在G1期晚期开始合成并一直持续到细胞进入S期。CyclinE与CDK2在G1～S期结合成CyclinE-CDK2复合物，呈现CDK2激酶活性，促进细胞通过G1/S限制点，进入S期。CyclinE的浓度对细胞周期的运转具有重要影响[6,18]。p21蛋白是细胞周期的负性调控因子，主要对G1期CDK以及Cyclin-CDK复合物起抑制作用，还可与DNA复制必需的PCNA结合，直接抑制DNA的复制，从而阻滞细胞周期于DNA复制的重要阶段[4]。当细胞受到非正常刺激时，p21的上调可能会在细胞周期的进程中起到刹车的作用[20]。p21 能够诱导细胞凋亡。CyclinE和p21是细胞周期调控过程中最为重要的控制点G1/S限制点的一对重要调控因子，决定了细胞核内的DNA复制是否能够完成，在生长条件不好或存在来自其他细胞的抑制信号的情况下，细胞有可能在G1期发生阻滞，甚至进入G0期[1]。

本实验中，cyclinE在2周时较0周变化不大，但p21增加幅度较大，由此可见，2周时胸腺细胞周期的变化以p21的上调为主要特征。由于p21的负性调控作用，胸腺细胞周期此时有可能发生G1/S期阻滞。而6周递增负荷运动中胸腺细胞凋亡蛋白变化的结果显示，2周时胸腺细胞Bax/Bcl-2的比值显著高于0周组，细胞凋亡增加。此时胸腺细胞凋亡的发生可能由胸腺细胞周期阻滞引起。分析是由于大鼠作为不惯常运动的动物，在受到运动负荷的刺激时，机体产生强烈的不适应现象，出现运动性免疫抑制。

递增负荷运动进行到4周时，胸腺细胞cyclinE和p21均有明显下调，但cyclinE的下降幅度较p21下降幅度小。说明cyclinE在受到运动刺激后2周时仍能保持一定水平，但到4周时出现较大幅下降。伴随cyclinE下降出现的p21大幅回落可能是机体为了维持其自身免疫平衡的保护性调节，从而使得胸腺细胞周期的破坏得到缓解。由第4周胸腺细胞凋亡的结果可见，Bax/Bcl-2比值也在4周出现了一过性的下降，凋亡程度减轻，与胸腺细胞周期调控因子的变化相一致，说明此时的运动性免疫抑制变浅。

递增负荷运动第6周时，cyclinE和p21均微有回升，cyclinE升高较多，而p21的增多并不显著。由大鼠胸腺结构观察可知，第6周时胸腺较之前出现萎缩，尽管机体为维持自身平衡仍使得cyclinE在胸腺细胞周期调控中占主导，从而促进细胞周期的运转，但整体上胸腺细胞数量的下降仍有可能表现出免疫机能的下降。6周递增负荷运动中胸腺细胞凋亡的变化趋势为此提供了佐证。

3.4 6周递增负荷运动过程中胸腺细胞周期CyclinB1的变化特征

CyclinB也是细胞周期调控系统中正性调节因子之一，包括CyclinB1～6这6个亚型。其中，CyclinB1在人类的细胞周期中最早被发现。CyclinB是G2/M转换期的重要调控因子，G2/M期则决定复制好的DNA能否顺利分到两个子细胞中，完成有丝分裂。CyclinB一般在G1期晚期开始合成，通过S期不断上调，到达G2期含量达到一定程度，并与CDK1结合，继而CDK1激酶活性开始出现。经过磷酸化后，CyclinB1-CDK1复合物可促进细胞周期从G2期到M期的过渡。在这一过程中，复制好的DNA将被分配到子细胞中去，从而完成细胞有丝分裂过程[4]。

细胞周期运转过程中最重要的调控点为G1/S期，大部分的细胞周期阻滞都发生在此时期，表现为DNA复制受到影响，而没有足够的DNA用于G2/M期进行有丝分裂。因此，细胞周期中G1/S期的重要性大于G2/M期[1]。就目前所掌握的文献，主要在G2/M期发挥作用的细胞周期抑制蛋白并不明确，因此本研究此部分只选择了起正性调节作用的CyclinB1进行大致分析。实验结果显示，0、2、4、6各周数据之间均无显著差异，但可看出在运动负荷逐渐递增过程中，胸腺细胞CyclinB1的表达呈现先上升后下降的变化趋势。可能是机体对运动负荷应激的适应性和保护性调节。为更好的解释胸腺细胞周期G2/M期的调控变化，还需进一步对与CyclinB1相拮抗的负性调节因子在长期递增负荷运动过程中的变化特征及其两者的变化之间的相互关系进行研究。

由于本实验胸腺CyclinB1在各周的检测结果变化不显著，可以看出胸腺细胞CyclinB1对递增负荷运动的刺激不及CyclinE敏感，可见G1/S期受到长期递增负荷运动影响更为显著。胸腺细胞在运动性免疫抑制发生发展过程中的凋亡可能主要是大部分细胞未能顺利通过G1/S检验点而进入到S期进行DNA的复制造成的。

4 结论

1.6周递增负荷运动过程中，随着运动负荷的增加，大鼠胸腺结构发生渐进性破坏。

2.6周递增负荷运动过程中，大鼠胸腺细胞凋亡增加以Bcl-2的变化为主导。

3.长期递增负荷运动可能主要是通过G1/S期的调控造成DNA复制障碍，阻滞胸腺细胞周期。细胞周期阻滞可能是胸腺细胞凋亡发生的原因之一。

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Effects of Long-term Incremental Exercise on Thymus Cell Apoptosis and Cell cycle Regulatory Proteins

ZHANG Xin-lei1,HAO Xuan-ming2,RUAN Yang3,QIN Fei2

Objective:To observe the variation characteristics of the thymus structure,the apoptosis proteins and the cell cycle regulatory proteins during long-term incremental exercise.Methods：80 male SD rats divided into control group and exercise group randomly.The exercise group participated in six weeks incremental treadmill training.The thymus structure were observed by HE staining,the expression of bax and bcl-2,cyclinE,p21 and cyclinB1 of thymus cell were detected by immunohistochemistry at 0 week,after 2 weeks exercise,4 weeks exercise and 6 weeks exercise.Results:1) The cells density of thymus decreased,the cortex and medulla of thymus lobule became fused,reticular formation in thymocytes were destructed,adipocytes and hemocytes occurred.2) Compared with WK0,bax/bcl-2 increased significantly in WK2 and WK6(P<0.01).Compared with WK2,it decreased with a significant difference in WK4 and WK6(P<0.01).While the ratio increased again in WK6 than in WK4(P<0.01).3) Compared with WK0,CyclinE increased slightly in WK2(P>0.05).While it reduced significantly in WK4 compared with WK0 and WK2(P<0.01).Compared with WK4,WK6 increased with a statistical difference(P<0.05).Making the p21 expression in WK0 as a reference,p21 extremely increased in WK2(P<0.01).Compared with WK2,WK4 reduced drastically(P<0.01).The expression slightly increased in WK6,but still less.The expression of CyclinB1 in rat thymocytes in WK2 was higher than WK0,and it reduced in WK4.Compared with WK4,the expression in WK6 increased slightly.The expression of CyclinB1 changed smoothly among every week and there was no significant difference(P>0.05).Conclusion:During six-week incremental exercise,the structure of rat thymus was destructed gradually.Bax/bcl-2 in thymus of rats shows a trend that increased firstly and then decreased,and finally increased again.The apoptosis of thymocytes increased and the changes of bcl-2 led this thymocyte apoptosis.The effect of the expression of thymus cell cycle regulatory proteins in G1/S by incremental exercise is more obviously than that in G2/M.The block of thymus cell cycle due to long-term incremental exercise mainly because of the DNA replication disorder which caused by the regulation of G1/S phase.Cell cycle arrest may be one of the mechanisms of thymocyte apoptosis.

incrementalexercise;thymus;cellapoptosis;cellcycle

2015-03-08；

2015-12-02

广东省体育局科研项目(GDSS2014181)。

张馨蕾(1988-)，女，陕西西安人，讲师，硕士，主要研究方向为运动免疫与健康、体育教育与训练，Tel：(029)88409648，E-mail：spacezhangxinlei@126.com；郝选明(1954-)，男，陕西韩城人，教授，博士，博士研究生导师，主要研究方向为运动免疫与健康，E-mail：850888696@qq.com；阮洋(1989-)，女，江西九江人，硕士，主要研究方向为运动免疫与健康，E-mail：ryamanda@163.com；覃飞(1987-)，女，甘肃兰州人，在读博士研究生，主要研究方向为运动免疫与健康，E-mail：qf_8707@163.com。

1.西安体育学院，陕西 西安 710068；2.华南师范大学 体育科学学院，广东 广州 510006；3.中国电器科学研究院，广东 广州 510300 1.Xi’an Physical Education University,Xi’an 710068，China;2.South China Normal University,Guangzhou 510006,China;3.China Electric Institute，Guangzhou 510300,China.

1000-677X(2015)12-0052-06

10.16469/j.css.201512007

G804.7

A