精子DNA损伤与辅助生殖研究前景

贺丹丹，李少鹏，李彦，赵晓瑞，王泽兰，潘潇（. 河北大学临床医学院，河北 保定 07000；. 河北大学基础医学院，河北 保定 07000；. 河北大学护理学院，河北 保定 07000）

精子DNA损伤与辅助生殖研究前景

贺丹丹1，李少鹏1，李彦2，赵晓瑞1，王泽兰1，潘潇3
（1. 河北大学临床医学院，河北 保定 071000；2. 河北大学基础医学院，河北 保定 071000；3. 河北大学护理学院，河北 保定 071000）

放化疗、吸烟、辐射、睾丸和附睾的温度变化等都会造成精子DNA不同程度的损伤。目前已有多种方法可以较好地检测精子DNA的损伤程度, 但是这些检测方法还有待完善。精子DNA损伤与育龄妇女的妊娠结局相关，为提高辅助生殖技术的成功率减少精子DNA损伤，可采用去除病因、中医药治疗、取睾丸精子行 ICSI和IMSI等方法。鉴于此，对精子DNA损伤的原因、检测方法、妊娠结局与治疗方法作一综述。

精子；DNA损伤；检测方法

本文引用：贺丹丹, 李少鹏, 李彦, 等.精子DNA损伤与辅助生殖研究前景[J]. 医学研究与教育, 2015, 32(1): 85-91.

随着辅助生殖技术的逐步发展，精子DNA损伤导致男性不育的问题越来越受到医学研究者的关注。当前研究表明，放化疗、吸烟、辐射、睾丸和附睾的温度升高等都在不同程度上对精子DNA造成损伤。目前已经有多种检测精子DNA完整性的方法，如彗星实验、精子染色质结构分析法、原位标记法等，但这些方法仍待改善。鉴于精子DNA损伤对妊娠结局有很大影响，现广大医学研究者已提出去除病因、中医药治疗、取睾丸精子行卵浆内单精子注射（ICSI）和卵浆内形态选择后单精子注射（IMSI）等方法对精子DNA损伤进行治疗。本文就对精子DNA损伤的原因、检测方法、妊娠结局与治疗方法作一综述。

1　精子DNA损伤的主要原因

1.1吸烟

Linschooten等[1]研究发现，吸烟会减少精子的产生，增加氧化应激、DNA损伤和脂质过氧化水平。Soares等[2]认为，吸烟导致精子的受精能力以及胚胎种植成功率降低。Jensen等[3]认为，长期接触烟草会减少成熟精子的数量。Calogero等[4]使用香烟烟雾的提取成分在试管内进行实验，研究显示，该提取物抑制精子的运动性，并且使线粒体膜电位较低的精子数量增加。另外，香烟烟雾提取成分对精子染色质的凝固和凋亡都有不利影响，还能诱导精子对于浓度和时间的依赖性，增加精子磷脂酰丝氨酸外化（一种早期凋亡的信号）和DNA碎片化（晚期凋亡的标志）的数量。

1.2睾丸温度升高

所有关于精液分析的课本和实验指南都在强调射出精液的温度的重要性，应尽量保持精液在运送到实验室时其温度与体温相近，Mortimer等[5]建议应尽可能在37 ℃的条件下射精，以确保精液高效液化。Makler等[6]研究发现，精液中的精子暴露在高温环境中大大降低了能动性、活力和生存率，暴露在低温环境，例如在4 ℃时，会降低精子的能动性，但其活力不会明显下降。

精子也存在一种冷休克现象，这是由于精子质膜磷脂的不可逆改变和离子失衡导致酶活性降低，尤其是过多负载钙离子的精子。脂质可以有序的凝胶状态或有序程度较低的流体状态(更灵活)存在。这些状态之间的转化发生在特定的温度范围之内，也与细胞膜特定的脂肪酸组成相关，后者决定了为什么“冷休克”对某些生物(例如野猪)精子的影响大于对其他生物(例如牛)精子的影响。Sieme等[7]研究发现，大多数哺乳动物细胞膜的熔点在0～15 ℃，但是细胞膜完全溶化不能突然发生，所以温度的改变可以导致细胞膜脂质的凝胶状态和流体状态同时存在，进而细胞膜发生构象改变，引起功能变化。由于上述原因，用于任何类型研究的精液样本，不论是在运往实验室过程中，还是在处理分析和临床应用的过程中，都必须保护精液免受超出生理范围的温度影响。

加热可以对精子的发生和形成产生巨大影响。Brindley[8]早在1982年就提出紧身内裤会提高睾丸温度并且导致不孕，因此，冷却睾丸可能会恢复生育能力。

1.3辐射

人类早就认识到接触X线对睾丸有很大的损伤，即使是相对较少的X线也能引起男性不育，其主要原因是精上皮对这类辐射极度敏感，导致精子的发生和成熟过程完全崩溃。Rowley等[9]实验发现，X线剂量低至1～6 Gy仍可导致人类精子数量减少，若剂量达到15 Gy（用于治疗男性睾丸原位癌的剂量）则可引起精子缺乏症。但是Singh等[10]研究发现，强度在0～2 Gy范围内，X线强度越高，精子DNA碎片化就越严重。

早在30年前Makler等[11]就发表了高频无线电波对人体有害的学说，2008年Agarwal等[12]证实，移动手机发出的电磁辐射对人体也有一定的损害。2012年Avendan˜o等[13]研究发现，无线网会影响精子的结构特征。De Iuliis等[14]认为，无线电波对精子损害的病理生理基础在于电磁辐射会增加线粒体的氧化过程，进而降低精子的运动性和活力，刺激DNA加合物的形成，最终导致DNA碎片化加重。因此，高频无线电波对男性生育能力的影响需要引起人类的高度重视。

1.4放疗和化疗

为提高肿瘤患者的生存率，放疗和化疗被广泛应用于临床工作中，并成为重要治疗手段。但是，一些重大的不良反应也随之而来，尤其对精液参数较差和患有严重精子DNA损伤的睾丸肿瘤和淋巴瘤的年轻男性患者影响很大。对肿瘤进行特意性治疗时，放、化疗会将快速增殖的睾丸生精上皮细胞作为天然靶细胞，使其受到严重损伤。放疗、化疗对于生精上皮的损伤相似，损伤后生精功能恢复大致需要几个月到几年不等，但是精子DNA损伤的存在时间要远远长于生精功能恢复的时间。所以，众多专家建议年轻男性肿瘤患者在结束放化疗12～24个月以后再考虑受孕，若将要进行放、化疗，可冻存适量健康精子，以便随时受孕。

2　精子DNA损伤的主要检测方法

2.1精子染色质结构分析法（SCSA）

1980年Evenson等[15]提出用吖啶橙的染色异质性区分伴有DNA损伤的精子与正常精子，此方法称为精子染色质结构分析法（SCSA）。正常精子DNA稳定的双链结构具有抗酸功能，有利于维持精子DNA的完整性。而损伤精子的鱼精蛋白中的巯基没有被氧化，其染色质结构变得松散，易受酸性物质影响成为单链DNA。本方法中的吖啶橙与正常DNA结合后，仍以单体形式呈现并发出绿色荧光，与单链DNA结合则形成聚合物形式并呈现黄色或者红色荧光[16]。流式细胞仪可以检测精子DNA发出的荧光，计算机利用这些荧光处理后得到的SCSA参数(DNA片段指数和高DNA可染性)来评估精子DNA的完整性。近些年，此方法已成为检验精子完整性的金标准。就临床预测价值而言, SCSA可以获得最有价值的临床数据并且提供可用的临床指南。

2.2彗星实验

彗星实验也就是单细胞凝胶电泳实验（SCGE)。Ostling和Johanson[17]首次提出SCGE方法，并由Singh完善此方法来更好地检测精子DNA损伤。SCGE主要通过检测DNA单链和双链的断裂，该机制为：将精子悬液与琼脂糖混均匀平铺在玻片上，凝固后精子DNA溶解并且解链成功，之后进行电泳。精子DNA损伤使DNA超螺旋结构松散，负电荷暴露，电泳时损伤的精子DNA向阳极移动，形成“彗星”的尾部，而未损伤的精子DNA会向阴极移动形成“彗星”头部[18]。洗涤玻片后在显微镜下观察用荧光染料染色的DNA，通过研究相应的参数来分析精子DNA损伤的结果。其中彗星的头尾长度可评估精子DNA损伤的程度，用于细胞毒理学研究。Cordelli等[19]2007年报道了关于改良彗星实验“牛精子彗星实验”作为生殖细胞基因毒性测试方法的内容，该方法以从海拉细胞中获得的蛋白质提取物为基础，在显微幻灯下对牛精子创造新的酶切位点，这样就可以检测在精子DNA加合物修复过程中的DNA断裂。

2.3原位标记法

原位标记有两种方法，分别是末端转移酶介导的脱氧三磷酸鸟苷末端标记法（TUNEL）和原位缺口平移法。TUNEL法常被用来确定细胞凋亡,也可以用来检测精子DNA碎片。通常使用流式细胞仪对其结果进行分析，也可以使用光学显微镜和荧光显微镜来评估精子DNA损伤程度。TUNEL是用异硫氰荧光素（FITC）[20]作标记物由末端转移酶催化的反应；原位缺口平移法是用生物素或者地高辛作标记物，由DNA聚合酶Ⅰ催化的反应。断裂的精子DNA在上述两种酶的催化下将FITC-dNTP连接在断裂DNA的末端，用流式细胞仪、光镜或者荧光显微镜计数伴有DNA损伤的精子数量。

2.4精子染色质扩散试验（SCD）

2003年Fernández等[21]提出SCD。先制作精子悬液，与琼脂糖均匀混合后平铺在玻片上，用酸溶液处理后去除核蛋白，并使用DAPI或Diff-Quik试剂染色，最后用荧光显微镜观察[22]。有完整DNA的精子经过以上步骤后DNA扩散形成特征性的光晕，而伴有损伤的精子DNA不会产生光晕或光晕很小。2005年SCD经过改善后制成了Halosperm试剂盒，由于保持了精子尾部的完整性，使用光学显微镜即可观察结果，很好地判断精子DNA损伤程度。

3　精子DNA损伤与辅助生殖技术结局

3.1精子DNA损伤与妊娠结局

3.1.1精子DNA碎片化与反复流产（RSA）

反复流产（RSA）指的是连续3次或3次以上的妊娠失败。精子DNA损伤程度与自然受孕率显著相关，当精子DNA损伤率（DFI）>30%时，自然受孕率几乎达到零。Carrell等[22]采用TUNEL方法分别对RSA患者丈夫、生育男性以及随机抽样男性的精子DNA的损伤程度进行测定，研究结果表明，RSA患者的丈夫精子DNA损伤的程度显著高于另外两组,并且还应用荧光原位杂交技术（FISH法）测定了三组实验对象精子染色体的非整倍性，结果RSA患者丈夫的精子染色体非整倍性也显著高于另外两组[23]。Carrell等[22]认为，男性精子DNA损伤和精子染色体非整倍性均会影响胚胎的发育分裂和种植，从而导致RSA发生。

3.1.2精子DNA损伤与宫腔内人工受精（IUI）的结局

IUI现已被广泛应用于男性不育症的临床治疗，成功率高达15%~20%。但是精子DNA损伤仍是影响IUI成功率的重要因素之一。研究[23]表明，DFI>30%时，IUI成功率非常低。对于进行IUI反复失败的患者应该及时行ICSI或ICMI治疗[24]。

3.1.3体外受精（IVF）和ICSI

体外受精逾越了对精子DNA完整性筛选的这个过程，使得采用SCSA方法检测DFI＞30%仍能受精成功。Moeeis等[25]认为，精子DNA损伤程度与行体外受精的妊娠率呈负相关。Bungum等[24]在2004年对IVF和ICSI的妊娠结局进行了研究。结果显示当DFI>27%时，ICSI的妊娠结局明显好于IVF，因此建议对于伴有精子DNA损伤的患者行ICSI助孕。但是Ahmadi等[26]认为，精子DNA损伤并不会影响受精的完成，但会导致囊胚形成率降低，最终导致胚胎种植和妊娠的失败率增高。Borini等[27]研究证实了Ahmadi的观点，该研究采用TUNEL法检测行IVF和ICSI治疗的患者精子DNA损伤的程度，结果表明精子DNA严重损伤的患者囊胚形成率、种植率和妊娠率均显著降低。

3.2精子DNA损伤对后代的影响

体外受精尤其是单精子注射技术使得伴有DNA损伤的精子成功受精，但同时也将一些遗传缺陷带给后代。Hansen等[28]研究发现，通过辅助生殖技术出生的婴儿伴有重大畸形的概率远高于自然出生的婴儿。Jackson等[29]对多项相关研究进行系统分析，结果发现IVF后代与自然妊娠的后代相比，围生期死亡、早产和低出生体重的风险均增高。Ørstavik等[30]对ICSI出生的婴儿进行染色体分析，研究表明，ICSI出生的婴儿患强直性脊柱炎的风险明显高于自然妊娠的婴儿。Fernández-Gonzalez等[31]研究发现，精子DNA损伤也会增加后代患癌症以及减短后代寿命的风险。

4　精子DNA损伤的治疗对策

4.1去除病因

由于多种病因可引起精子DNA损伤，解除病因应是有效的治疗方法之一。首先应改善生活习惯，避免长时间驾驶、高温沐浴等，另外戒烟和远离生活污染物可降低毒性物质对精子DNA的损害[32]。精索静脉曲张患者，可结扎精索静脉或进行其他有效治疗；生殖道感染，应尽快进行抗感染治疗，降低精浆活性氧（ROS）的含量；对于想要晚育的男性或即将进行放化疗的肿瘤男性患者，可先行精子欲冻存，以便以后随时受孕，且不会导致精子DNA出现严重损伤。

4.2中医药治疗

中医药对男性精子DNA损伤的治疗有其独特的疗效。金保方等[33]发现，应用适量活血补肾养精的中药胶囊，并配合补锌补硒的中药，可以提高精子DNA的完整性，减轻精子DNA损伤。同年，金保方等[34]应用“加味水陆二仙丹”为主药的中药方成功治愈1例右侧精原细胞瘤手术后因放疗引起的无精症，并用ICSI使其配偶受孕成功，进一步证明中医药可降低精子DNA损伤的程度。

4.3ICSI与IMSI

睾丸精子DNA损伤程度很大程度上轻于精液中的精子，机制可能是精子DNA损伤发生在睾丸后。Greco等[35]检测并对比18例ICSI治疗连续失败的男性患者射出的精子与睾丸精子，发现射出精子DNA的损伤程度明显高于睾丸精子DNA。采用精子DNA损伤程度较轻的睾丸精子替代精液中精子对行ICSI反复失败的患者再次行ICSI治疗，胚胎种植率以及其配偶的妊娠率都大幅度提高。更重要的是，应用此方法改进ICSI后，出生的婴儿伴有重大畸形的概率也显著降低。近几年，众多研究表明IMSI也可有效降低精子DNA的损伤程度，帮助提高妊娠率，降低畸胎率。随着研究的进一步发展，IMSI很可能会代替ICSI成为治疗精子DNA损伤而导致的男性不育的主要方法。

5　结语

精子DNA损伤对男性不孕与辅助生殖技术在临床上有重要的意义。目前寻找一种更简易、更易于标准化的精子DNA损伤的检测方法尤为重要。去掉致病因素、药物治疗等都能在一定程度上改善精子DNA损伤的程度，有助于降低ICSI和IMSI后代伴有重大畸形的风险。相信随着医学技术的发展与医学实验的进一步研究，许多关于精子DNA损伤的问题会更明朗，精子DNA损伤的测定也会更好地在临床上为男性不育的诊疗提供帮助。

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（责任编辑：刘俊华）

Prospect of sperm DNA damage and assisted reproductive technology research

HE Dandan1, LI Shaopeng1, LI Yan2, ZHAO Xiaorui1, WANG Zelan1,PAN Xiao3
(1. College of Clinical Medical Science of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. College of Basic Medical Science of Hebei University, Baoding 071000, China; 3. Nursing College of Hebei University, Baoding 071000, China)

There are multiple factors which cause sperm DNA damage,such as radiotherapy or chemotherapy, smoking, electromagnetic radiation and temperature of the testis/epididymis. Improving the methods of sperm DNA damage detection is still necessary. A number of studies have reported that sperm DNA damage is associated with reproductive outcome. For the sake of succeeding in ART and the reducing of sperm DNA damage, some treatments are taken into consideration, such as exterminating the causes, oral antioxidant drugs, traditional Chinese medicine and ICSI /IMSI with testis sperm. This review focuses on the mechanism and detection of sperm DNA damage, it’s association with reproductive outcomes, and relevant treatment strategies in assisted reproductive technology.

sperm; DNA damage; methods of sperm DNA damage detection

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.01.020

R69

A

1674-490X(2015)01-0085-07

2014-11-11

贺丹丹（1992—），女，河北张家口人。E-mail: 18730217918@163.com