哺乳动物卵母细胞冷冻保存技术研究进展

王士勇，杨月春，2，李晓霞，刁云飞，梁永军，许保增※

(1．中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室，长春 130112；2．吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132012；3．吉林省四平市铁西区畜牧管理服务中心，吉林 四平 136000)

哺乳动物卵母细胞冷冻保存研究一直备受人们关注，一方面，冷冻保存卵母细胞是动物遗传资源保存的一种重要手段；另一方面，随着哺乳动物胚胎工程技术的日益发展，对卵母细胞的数量和质量要求越来越高；同时，人类辅助生殖研究需要卵母细胞冷冻保存作为技术支撑。到目前为止，人们对多种动物的体细胞冷冻保存技术已经成熟，但是卵母细胞的冷冻保存效率还远低于其他细胞，其原因可能是卵母细胞体积大、细胞膜的结构和渗透性与其他细胞相异、冷冻过程中对冷冻保护剂造成的渗透压变化较敏感等[1]。近年来，人们对卵母细胞冷冻保存研究做了细致的探索和研究，提出了很多新技术、新方法和新观点。众所周知，哺乳动物卵母细胞冷冻保存一般包括添加抗冻保护剂、冷冻保存、解冻复苏和洗脱冷冻保护剂等几个步骤，每一步操作都会由于渗透压差造成卵母细胞的体积变化而导致其微结构损伤甚至死亡[2]。本文就卵母细胞冷冻保存研究中所涉及的方法、载体、抗冻保护剂和新的研究观点进行综述，为进一步研究和改进卵母细胞冷冻保存技术提供参考。

1 冷冻方法

冷冻方法是影响卵母细胞冷冻效果的一个重要因素，常用的卵母细胞冷冻方法有慢速冷冻法和玻璃化冷冻法(快速冷冻法)2种。

1.1 慢速冷冻方法

卵母细胞进行慢速冷冻时需要采用程序降温仪，其价格昂贵，操作步骤繁琐，降温时间较长，对卵母细胞解冻后的体外受精率、卵裂率及囊胚发育率影响较大，而且，在冷冻除人以外的动物未成熟卵母细胞时效果并不如意，虽然有移植后获得了成活个体的报道[3，4]，但逐步被玻璃化冷冻方法所取代。Lim等[5]利用慢速冷冻法冷冻牛卵母细胞的研究表明，成熟与未成熟卵母细胞的抗冻性具有差异，冻融方法影响冷冻卵母细胞解冻后的存活率和发育能力。研究表明[6，7]，采用慢速冷冻方法冷冻卵母细胞时，成熟的卵母细胞冷冻后其受精能力、发育率和胚胎质量要明显优于未成熟的。但是在实际生产应用时，往往取得的卵母细胞恰恰是未成熟的，所以其应用范围非常受限。

1.2 玻璃化冷冻方法

玻璃化冷冻保存不需昂贵的程序冷冻仪器，但是其效果较慢速冷冻明显行之有效，是目前普遍采用的卵母细胞冷冻方法。其优点是操作简单快捷、降温迅速，能够减少在冷冻过程中形成的冰晶，降温过程中卵母细胞内、外溶液呈玻璃样，从而避免形成冰晶所带来的机械性损伤。但是该方法也存在不可忽视的缺点，因为玻璃化冷冻时添加高浓度的冷冻保护剂容易引起化学中毒[8]，一旦操作过慢还可能会引起强烈地渗透损伤，从而破坏卵母细胞骨架结构，导致纺锤体和染色体结构异常，冻融后卵母细胞的存活率、形态正常率、受精率和发育力等有所下降[9]。实现玻璃化冷冻通常有2条途径，一条是极大地提高冷却速率，另一条是增加保护剂的浓度[10]。因此，尽量选择化学毒性小的冷冻保护剂及组合比例以及缩短冷冻液处理时间是玻璃化冷冻效果好坏的关键之一。

2 常用的冷冻载体

卵母细胞冷冻保存时，为了解冻后回收方便，一般需要将卵母细胞装在载体中冷冻，常用的冷冻载体主要有冷冻细管、开放性拉长细管(Open Pulled Straw，OPS)和冷冻环(Cryoloop)等，也有人用玻璃微管(Glass micropipette vitrification，GMP)、封口式拉长细管(Closed Pulled Straw，CPS)、塑料微量吸头(Plastic micropipette)和电镜铜网(electron microscope grids，EMG)等载体[11]。选择冷冻载体时尽量选择容纳冷冻液容积较小且热导性较好的，这样冷冻液降温速度快。

2.1 冷冻细管

冷冻卵母细胞采用的细管载体通常为冷冻精液所用的麦管。在卵母细胞冷冻研究之初，由于细管冷冻较适宜程序冷冻仪、能够进行批量冷冻而受到广泛关注，并在胚胎冷冻上达到商用水平，但这种载体采用慢速冷冻时同样操作时间较长，需要昂贵的仪器，因为细管温度下降速率受其导热性差所影响，降温相对较慢，容易加大渗透性抗冻保护剂对卵母细胞的毒性损伤，随着冷冻效果越来越被关注和拉长细管的开发使用而逐渐呈被淘汰趋势。

2.2 拉长细管

拉长细管主要分为2种，一种是开放的拉长细管，一种是封闭的拉长细管。OPS法是将细管加热后拉长变细，管壁变薄，这样细管容积变小，装载微量冷冻液即可完成冷冻保存过程，极大提高了冷冻速度，其降温速率能达到20 000℃/min以上[11]。OPS技术是为超快速玻璃化冷冻技术设计的专用工具，在卵母细胞和胚胎冷冻方面迅速得到推广应用，卵母细胞冷冻效率不仅得到较大提高，而且解冻后的卵母细胞质量较常规细管法明显增强[12]。OPS法由于具有虹吸作用，卵母细胞的装载时间相对缩短，与常规细管法相比不仅提高了冷冻和解冻的速度，同时减少了透明带的损伤和渗透损伤[13]。CPS法与OPS法相似，研究表明，二者冷冻效率也没有较大差异[14，15]。GMP法是在OPS法的原理上衍生而来的，只不过是将塑料吸管换成玻璃毛细管，由于其内径较小，同样长度的玻璃毛细管拉长后容积约为OPS管的1/19，因此，GMP法比OPS法具有更快的冷冻速率，且由于比重较大不会漂浮在液氮中[16]。

2.3 冷冻环

冷冻环是直径0.5mm～0.7mm的尼龙环，冷冻卵母细胞之前，在冷冻环上用冷冻液制作一层薄膜，然后将卵母细胞小心移到冷冻液薄膜上，这个过程较为精细，要求尽量减少冷冻液的同时将卵母细胞放置在薄膜上，然后迅速投入液氮中[17]。由于没有细管等的隔离，而且冷冻液量少，冷冻解冻过程中温度变化速度既迅速又均匀，能够有效减少细胞的机械和渗透损伤[18]。如果长期保存卵母细胞，可以将冷冻环插入带有磁性的冷冻帽上，放入液氮预冷的配套冷冻管中，这个冷冻管开口端带有铁圈，能够有力吸住磁性冷冻帽，而且冷冻管底部有透气孔，利于液氮迅速进入冷冻管。冷冻环法较之OPS法所需冷冻液更少，因此冷冻速率更快，其冷冻效果更佳[19]。

3 抗冻保护剂

抗冻保护剂是在冷冻液中添加的主要为了防止细胞冷冻损伤的物质，主要分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂2种。渗透性保护剂主要有乙二醇、甘油、丙二醇、二甲基亚砜、丁二醇、乙酰胺等。这类抗冻保护剂能够使细胞迅速脱水，同时能够降低冷冻液的凝固点，从而减少细胞内形成冰晶而造成对各种细胞器机械损伤[20]。非渗透性保护剂主要包括葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖等小分子量糖类，同时也包括大分子量的聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、聚乙二醇等物质。这类抗冻保护剂能够增加并稳定细胞外冷冻液的渗透压，从而在外部达到细胞脱水目的的同时降低渗透损伤，并且可以降低渗透性抗冻保护剂的浓度，减少毒性损伤[21]。

在众多抗冻保护剂中，最常用的主要是甘油、二甲基亚砜、蔗糖、海藻糖等物质。海藻糖是由2个葡萄糖分子以1，1-糖苷键构成的非还原性糖，在冷冻液中添加后由于其热稳定性好而使玻璃化效果温域增长，同时对卵母细胞的渗透保护作用被人们广泛接受，应用较为广泛[22]。

4 卵母细胞体积调控

在卵母细胞玻璃化冻融过程中，由于细胞内、外渗透压差的存在，会造成卵母细胞因快速脱水或充水体积急剧皱缩或膨胀，从而导致卵母细胞的透明带断裂、纺锤体失常、细胞骨架损伤、功能分子平衡破坏等[23]。卵母细胞在冻融过程中受渗透压影响而体积变化后，渗透压调节分子通道会被激活，通过提高细胞内无机离子和有机渗透压而调节细胞内部分子的浓度，使卵母细胞达到正常体积[24]。近年来，通过调控卵母细胞体积、减少冻融过程中的渗透损伤来提高其冷冻效率的研究日益受到关注。Moawad等[25]在解冻后的胚胎培养液中添加渗透压调节分子L-胆碱，显著提高了小鼠卵母细胞冻融后的体外受精率和胚胎体外发育率，说明渗透压对卵母细胞的影响不仅存在于冻融过程中，其调节作用至少能够持续到解冻后受精及其后的胚胎发育阶段。

5 展望

近年来，卵母细胞冷冻保存技术研究虽然得到了很大的进展，但是仍然难以摆脱渗透性抗冻保护剂细胞毒性的困扰，在冷冻载体上难以达到量产推广的程度，冻融后的卵母细胞发育潜力还有提高的空间。相信在不久的将来，细胞体积调控理论能够得到丰富，更多的渗透调节物质能够被开发应用为抗冻保护剂，卵母细胞冷冻保存效率会得到进一步提高，从而为人类生殖医学、胚胎生物工程和动物种质资源保存提供有力支撑和巨大的推动作用。

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