小干扰RNA技术在膀胱癌研究中的应用和展望

栾 婷，王海峰（综述），王剑松（审校）

（昆明医科大学第二附属医院泌尿外科 云南省泌尿外科研究所，昆明 650101）

膀胱癌绝大多数来自上皮组织，其中90%以上为移行上皮肿瘤［1］。膀胱癌的病因复杂，与环境因素、遗传因素、癌基因的激活和抑癌基因的失活等的作用有关，但具体的发生机制尚不清楚。目前膀胱癌的治疗多数仍然采用手术为主放化疗为辅的综合治疗方案，但该治疗方案还存有很多问题，如手术创伤大、患者耐受性差、化疗多重耐药现象、术后复发普遍（复发率50%～70%）等，这些问题促使人们寻求更有效的治疗方法、提高患者的生存率，这是泌尿外科研究的重要课题。如果能明确膀胱癌的发生机制并从基因水平对其进行治疗，就能从根本上逆转了肿瘤的发展，从而可能达到治愈的目的，给肿瘤治疗带来新的希望。近年来基因的研究一直是膀胱癌研究的热点问题，在动物实验和临床试验中均显示出了巨大的潜力和良好的前景。寻求一种有效的技术方法作用于目的基因一直是基因研究中的一大难题。

小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术是指利用长度为21～25 nt的小的双链RNA降解同源信使 RNA（messenger RNA，mRNA）以引起特定mRNA的沉默，从而使其失去作用［2］。siRNA技术因其具备高特异性、高效性、简便易行等特点，并且具有强大的基因阻断作用，现已广泛地用于各种疾病的基因功能研究、信号转导、基因治疗等方面，成为医学各领域的研究热点，并有望成为一种新的治疗癌症的有效途径。利用RNA干扰沉默异常的基因的表达是在癌症治疗中新出现的方法，具有潜在临床应用价值，也为膀胱癌的基因治疗开辟了一条新道路。通过查阅近年来国内外相关文献，对siRNA技术在膀胱癌研究中的应用和进展进行综述。

1 siRNA技术的发展

1990 年 Jorgensen等为了加深矮牵牛花的紫色，向其中导入了一个含有强启动子的色素基因，但结果却是矮牵牛花出现颜色变浅甚至白色，研究发现这是因为导入的基因和同源的内源基因的表达均被抑制了，这个现象称为共抑制现象［3］。1995年，Guo 和 Kempheus［4］在研究 秀 丽线虫中par-1基因的功能时发现不论是反义RNA还是作为对照的正义RNA都能阻断par-1基因的表达。这种现象与当时认为的反义RNA技术的机制不符。1998年，Fire等［5］在研究华丽新小杆线虫基因组计划时发现了双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）能特异性和选择性地抑制目的基因的表达，他们将这种现象命名为RNA干扰。这个发现澄清了此前一系列令人们困惑的实验现象。随后RNA干扰在全球展开了广泛的研究和应用，并在动物中相继证实。2001年，Elbashir等［6］发现，人工合成的长度为 21～23 nt的 dsRNA，即小片段siRNA，能触发哺乳动物细胞的特异性RNA干扰，对哺乳动物细胞中特定的基因表达进行抑制，从而为siRNA技术的发展奠定了基础。

2 siRNA技术的作用机制

在RNA干扰的起始阶段，由外源导入的dsRNA在胞质被dsRNA特异性核酸内切酶（dsRNA specific endonuclease，Dicer）在依赖ATP的作用下逐步切割为21～23 nt长的siRNA，又称为引导RNAs。Dicer可特异识别 dsRNA，将 dsRNA降解为3'端有2个碱基突出的21～23 nt的siRNA。在RNA干扰的效应阶段，形成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）同时识别降解mRNA。RISC是一种RNA-蛋白质复合物，通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。在腺苷三磷酸的作用下可将双链siRNA解开变为活化形式的单链siRNA，通过碱基配对定位到同源mRNA上，特异性降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默，影响mRNA的稳定性，使其失活［2］。此外，研究表明［7］RISC与mRNA结合后，在RNA依赖性RNA多聚酶的作用下可形成新的dsRNA;而切断后的mRNA被核酸外切酶降解后，在RdRP作用下也可形成 dsRNA，新形成的dsRNA又循环上述过程，再次被Dicer酶识别、切割，形成新的siRNA并作用于靶向mRNA，这种放大的瀑布式作用能在短时间内迅速有效地使靶向mRNA完全降解，从而抑制相应基因的表达。

与其他基因沉默的技术相比，siRNA技术有着显著的特点和优势［8］:①特异性强，只能特异地降解靶基因的mRNA;且单个碱基的改变，就有可能导致RNA干扰作用的减弱乃至于消失;②高效性，由于siRNA技术的过程中有瀑布式放大效应，siRNA能在低浓度下显著抑制基因表达甚至完全敲除;③siRNA有浓度依赖性和时间依赖性;④dsRNA长度限制性，dsRNA为21～23 nt及dsRNA＞30 nt，特异性显著降低;⑤可传播性，siRNA可扩散到整个机体并可传递给子一代。

3 siRNA技术在膀胱癌研究中的应用

膀胱癌的发生、浸润和转移与癌基因和抑癌基因表达的失调密切相关。如果能将失调基因的发生机制研究清楚，并对其进行靶向治疗，就能提高肿瘤治疗的特异性，减少或避免治疗过程中对正常组织细胞造成损害，是非常有希望的肿瘤治疗方法。因此，肿瘤的靶向基因治疗是当今医学研究的热点之一，而寻找膀胱癌基因治疗的靶点成为有待解决的问题。

3.1 研究膀胱癌相关基因的功能 膀胱癌的发病机制仍然不清楚，是多种因素共同作用的结果。Bc1-2基因在肿瘤发生、发展中起重要的促进作用，它通过抑制细胞凋亡、促血管生成因子的分泌促进新生血管形成、使肿瘤细胞对许多化疗药物和放疗的杀伤作用产生耐受促进肿瘤的发生、发展［9］。许可慰等［10］通过针对 Bcl-2基因的1009、1147、1210位点设计并合成表达siRNA的正、反义链DNA模板，再与带有绿色蛋白荧光基因的pSIH1.H1-copGFP载体连接，构建重组质粒，转染细胞后的目的片段在H1启动子的作用下不断表达shRNA，剪切生成siRNA形成RISC，持续作用于Bc1-2 mRNA切割靶转录体，从而抑制Bcl-2基因的表达和功能，构建的表达人膀胱癌Bcl-2-siRNA的慢病毒载体及建立的稳定转染细胞株，为后期研究Bcl-2在膀胱癌发病中的作用机制提供了实验基础。

整合素连接酶（integrin-linked kinase，ILK）是控制细胞对脂多糖反应的一个普遍表达的蛋白激酶，通过整合诱导肌动蛋白细胞骨架的重构来介导细胞的生长、运动、迁移、侵袭和血管生成［11-12］。ILK在浸润性膀胱癌中高表达并促进裸鼠膀胱癌移植瘤的生长。高娟等［13］通过siRNA技术沉默膀胱癌ILK基因检测其对细胞凋亡的影响，结果发现，ILK siRNA通过调节关键蛋白的表达，如Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3，在细胞凋亡中发挥重要作用。该结果表明ILK有望成为膀胱癌临床诊断和治疗的一个新的靶点。

3.2 在膀胱癌治疗中的应用 血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种可促进新生血管的生成和肿瘤的生长的生长因子。膀胱癌患者血清样本中VEGF高表达与病理分期和淋巴结转移有关，同时也预示着预后差和易复发［14］。这些特点使VEGF成为膀胱癌抗血管生成疗法的理想靶点，RNA干扰技术则能有效抑制VEGF的表达并降低其生物活性。Alnylam研发了一种siRNA药物——ALN-VSP02，通过静脉给药来治疗肝癌及其他实体瘤，并于2009年4月进入了Ⅰ期临床试验，该药靶向作用于肿瘤细胞高表达的纺锤体驱动蛋白和VEGF，通过抑制两者的表达从而抑制肿瘤的生长和转移，据2010年11月发布的数据显示，ALN-VSP02在大部分受试者中耐受性良好［15］，这给siRNA技术应用于膀胱癌的临床治疗带来了希望。

凋亡抑制因子存活蛋白是一个新近克隆的凋亡抑制基因，它只存在于人的各种胚胎组织中，除胸腺和生殖腺外，在正常分化成熟组织中检测不到它的表达，而当细胞发生恶变时又重新表达。由于存活蛋白只在恶变的组织中表达，因此检测膀胱肿瘤患者尿液中的存活蛋白，可为肿瘤的早期诊断、监测复发以及预测预后提供帮助［16-17］。Ku等［18］利用 RNA干扰研究存活蛋白基因对人膀胱癌T24细胞的生长和对细胞周期的影响时发现，存活蛋白表达的增加抑制了T24细胞胱天蛋白酶3活性，从而引起细胞凋亡，说明RNA干扰能有效地抑制存活蛋白表达的T24细胞。Seth等［19］将靶向作用于存活蛋白的siRNA脂质体转入膀胱癌KU-7-1uc细胞中，发现半抑制浓度仅为29 pmol/L，转染后96 h细胞生长抑制率达40%，胱天蛋白酶3/7活性增长7～8倍:而向种植该细胞的荷瘤鼠注射0.5或1.0 mg/kg脂质体后肿瘤体积分别下降5或10倍，均P＜0.01，表明膀胱内灌注存活蛋白的siRNA可作为潜在治疗膀胱癌的治疗方式。

人源性长寿保障基因Ⅱ型（homo sapiens longevity assurance homologue2，LASS2）是我国新近发现的肿瘤转移抑制基因，在促进肿瘤细胞生长、增殖、凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭及转移中起重要作用［20］。王海峰等［21］研究膀胱癌 BIU-87、EJ、T24和EJ-M3细胞的增殖和侵袭能力时，运用实时定量聚合酶链反应法和蛋白质印迹（Western blot法）检测4株细胞中LASS2基因的表达水平，发现随着膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的增强，LASS2的表达水平降低。徐晓艳等［22-23］通过脂质体转染法将特异性沉默LASS2基因的siRNA转染入前列腺癌 PC-3M-2B4细胞，检测 LASS2 siRNA对细胞LASS2基因和蛋白表达的抑制作用，结果显示siRNA能显著抑制PC-3M-2B4细胞LASS2基因mRNA和蛋白的表达，抑制率分别为84.5%和60%。LASS2 siRNA-2转染细胞后，通过提高囊泡型V-ATP酶 （vacuolar-H+-ATPase，V-ATPase）的活性使细胞外氢离子浓度显著升高，同时分泌活性形式的基质金属蛋白酶2水平增加，且细胞的体外迁移及侵袭能力明显高于空白对照组。这些结果表明特异性siRNA沉默LASS2是通过激活V-ATPase使细胞外氢离子浓度升高，从而激活基质金属蛋白酶2，促进人前列腺癌细胞的体外侵袭能力。因此，LASS2基因可作为一种新的肿瘤转移抑制基因来用于膀胱癌的治疗中。

3.3 逆转膀胱癌细胞对化疗药物的耐药 膀胱癌目前以手术为主化疗为辅的治疗为主要方案，但多年来肿瘤细胞的耐药现象一直困扰着临床医师，对抗肿瘤药物耐药仍然是导致化疗患者治疗失败主要原因。随着对分子机制研究的深入，对肿瘤细胞产生耐药现象的相关基因研究也逐渐受到了人们的关注。siRNA技术作为一种基因表达沉默途径，其应用有望有效逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药现象。Eissa等［24］报道他们构建了一种能下调VEGF表达水平的腺病毒载体，与化疗药物联合使用时显著延缓了裸鼠移植膀胱癌的生长，与单独应用化疗药物相比具有明显差异，并且耐受性很好。徐晓艳等［23］利用RNA干扰技术在体外沉默JWA基因抑制膀胱癌细胞的增殖，发现还显著增强了吉西他滨化疗的敏感性。多药耐药（multidrug resistance，MDR）指肿瘤细胞除了对作用于它的药物产生耐药，也对未作用于它的不同种类的药物产生耐药，其分子基础是MDR编码的糖蛋白过度表达，它是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的重要防御机制，也是导致化疗失败的主要原因之一［26］。陈从波等［27］研究设计以人膀胱癌细胞系/阿霉素细胞株MDR1基因为靶标的siRNA，观察其对MDR1基因表达及细胞株耐药性的影响，结果显示siRNA能下调MDR1基因的mRNA及蛋白表达，从而抑制该基因编码的糖蛋白的表达，使细胞内阿霉素积累量显著增加。本实验结果说明siRNA可能成为逆转MDR的新方法，如果能联合应用多种耐药机制的siRNA，肿瘤细胞的耐药性将会得到更有效的逆转。

4 问题与展望

近年来siRNA技术得到日新月异的发展，作为新的基因治疗手段，siRNA技术的研究成果已经引起了巨大反响，成为基因功能与治疗研究中最有效的工具，siRNA技术具有巨大的发展潜力。但在实际应用领域，仍然存在一些问题有待解决:①目前siRNA分子设计面临的主要难题是脱靶问题，人工合成的siRNA会引起非靶标基因的沉默，这也是阻碍siRNA临床治疗发展的主要障碍［28］。②siRNA在体内时转染效率偏低，将siRNA靶向转运至靶器官和靶细胞同时保证有效的转染细胞，这是阻碍siRNA技术用于临床上的重要难题。目前已有研究将腺病毒作为载体在体内实现RNAi［29］，但其高效性和安全性仍有待商榷，目前还需要寻找更为高效、低毒的适于人体的转染系统。③siRNA在体内稳定性差，作用时间短。④膀胱癌的发病机制是癌基因、抑癌基因等多种因素共同作用的结果，但目前siRNA技术的研究主要局限于对单一基因功能的沉默，这不能使膀胱癌的治疗达到满意的结果。⑤目前的研究和所得成果主要局限于动物实验，要想应用于临床实践还有很长的一段路要走。但随着siRNA技术在医学领域和生命生物工程领域研究的不断深入，各个问题将被一一击破。相信在不久的将来，通过基础和临床众多学者的共同努力，siRNA技术必将为膀胱癌患者带来新的希望。

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