染色质修饰因子在诱导多能干细胞重编程中的研究进展

吴兴武(综述)，林　戈，胡　亮※(审较)

(1.中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙 410000； 2.人类干细胞国家工程研究中心，长沙 410000)



分子生物医学

染色质修饰因子在诱导多能干细胞重编程中的研究进展

吴兴武1△(综述)，林戈1,2，胡亮1,2※(审较)

(1.中南大学生殖与干细胞工程研究所，长沙 410000； 2.人类干细胞国家工程研究中心，长沙 410000)

摘要：诱导多能干细胞(iPSCs)因其独特优势在再生医学领域具有广泛的应用前景。近年来，一系列的研究发现染色质修饰因子对于干性的维持和促进重编程进程不可或缺。在重编程过程中抑制一些染色质修饰酶能提高重编程效率，而敲减或敲除一些染色质修饰因子则使重编程效率下降或不能实现重编程。该文就近几年发现的在iPSCs重编程过程中发挥重要作用的染色质修饰因子及其作用机制予以综述。

关键词：重编程；染色质修饰因子；诱导多能干细胞

通过体细胞重编程获得的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)因其自我更新、多谱系分化能力和免疫排异反应等方面的优势而在再生医学领域备受青睐[1]。iPSCs重编程是一个缓慢、渐进且低效的过程，涉及染色质的广泛重新组织，包括DNA的甲基化、组蛋白的修饰和核小体的重塑等过程[2]。染色质修饰因子主要指DNA甲基转移酶、组蛋白修饰(主要包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化等)酶及ATP酶依赖的染色质重塑复合体(chromatin-remodeling complexes，CRCs)三类。在重编程中，它们和转录因子共同参与染色质的重构、全基因组的表观状态改变及基因的转录等过程。对重编程过程中染色质修饰因子的进一步了解可能对iPSCs的应用起积极的作用。现就染色质修饰因子在iPSCs重编程中的研究进展予以综述。

1多能性干细胞和体细胞的染色质状态

1.1多能性干细胞的开放染色质状态及其特异性标记真核细胞的DNA和组蛋白结合在一起构成染色质，在这种环境下进行基因表达和细胞命运决定。许多干祖细胞的组织学切片都被描述为具有典型的松弛而开放染色质结构，并缺乏致密异染色质[3]。随着研究的深入，越来越多的证据显示，多能性干细胞的染色质处于开放状态，其染色质总体结构松散，常染色质和异染色质的比例明显高于分化后的细胞[4]。用核酸酶分析全基因组紧缩状态显示，胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)比其分化后细胞的对核酸酶敏感性更高，说明其染色质可接近性高，染色质松弛而开放[5]。

应用DNA甲基化测序和组蛋白修饰的特异性抗体对比分析多能性干细胞和分化后细胞的表观状态发现了一些开放状态染色质和关闭状态染色质的一些特异标记[6]：开放状态染色质通常是DNA低甲基化、组蛋白H3/H4ac、H3K4me3，而关闭状态染色质则是DNA高甲基化、H3K9me2/3和H3K27me3、富含异染色质蛋白1。

1.2染色质修饰因子、开放染色质与重编程的关系处于开放状态的多能性干细胞染色质，能允许转录程序迅速向分化转变。这对于多能性干细胞尤为重要，因为它提供了十分广泛的分化程序选择范围[7]。体细胞重编程为多能性的过程，细胞的染色质状态由关闭的紧缩向开放的松弛状态发生剧烈转变，在此过程中发挥关键作用的染色质修饰因子扮演不可或缺的角色。已有许多研究通过过表达或基因敲减(敲除)来研究其在此过程中的作用机制。目前已经发现DNA甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白去乙酰化酶、CRCs等在重编程过程中发挥重要作用。

2DNA甲基化和去甲基化

在细胞融合实验中发现DNA去甲基化酶诱导激活DNA脱氨酶在细胞重编程过程中对于OCT4和NANOG的表达是必需的[8]。重编程过程中用5-氮杂胞苷抑制DNA甲基化能使iPSCs实现完全重编程并提高重编程效率[9]。这两个实验说明，DNA去甲基化是重编程中不得不逾越的一个重要障碍。

2.1DNA甲基化调控基因转录DNA甲基化是指在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上发生甲基化的共价修饰。哺乳动物中，主要通过三种酶进行DNA甲基化修饰：DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1，DNMT3A和DNMT3B[10]。DNMT1维持基因组区域或子代细胞中DNA的甲基化状态，DNMT3A/3B是重新发生DNA甲基转移酶，即使未甲基化的胞嘧啶发生甲基化。DNA甲基化通常被认为与基因表达沉默相关。如NANOG基因的启动子区域在体细胞中是高甲基化的，而在ESCs中则是未甲基化的[11]。Mikkelsen等[9]发现，DNA的甲基化与处于抑制状态的染色质结构相关。这可能是DNA甲基化调控基因表达的原因，因为发生甲基化的元件的可接近性降低，从而抑制基因转录。

2.2DNA甲基转移酶对于体细胞重编程必不可少在iPSC的重编程的过程中DNA的甲基化状态需要由体细胞状态逐渐向多能性状态转变。研究者通过抑制或敲减DNMT1，发现DNA甲基化水平下降，重编程进程得以促进，说明DNMT1活性的抑制在iPSCs重编程过程中是十分重要的[9]。另有研究表明，DNMT3A/3B对于重编程并不是必需的，尽管产生的iPSCs 只有当DNMT3A/3B重新被转到细胞中才能获得真正的发育潜能[12]。在iPSCs的传代过程中直到其DNA甲基化状态完全发生转变，其多能性状态才能确定，即发生完全重编程[13]。

研究者发现一些调控DNA甲基化的基因(如Tet1、Tet2、Tet3和Parp1等)对于iPSC的产生是必不可少的：同时敲除Tet1、Tet2、Tet3则iPSCs重编程不能实现[14]。对重编程机制的深入研究发现,Tet2和Parp1能促进Oct4结合到Nanog和Esrrb区域而促进重编程的发生[15]。TET1则被招募到NANOG的结合区域增强一系列关键基因的表达从而促进重编程进程[16]。

2.3DNA甲基化相关小分子影响重编程研究还发现一些小分子化合物通过改变DNA甲基化影响iPSCs的重编程过程。维生素C促进重编程的报道中发现其可能是通过DNA去甲基化酶Tet家族发挥作用[17]。valproic acid(丙戊酸)能特异地抑制DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶的活性，从而提高iPSCs的重编程效率[18]。Butyrate(丁酸盐)促进人iPSCs 的重编程可能是通过促进DNA去甲基化酶和H3乙酰化酶的表达而使内源性多能性基因(如OCT4和DPPA2)表达实现的[19]。

3组蛋白修饰

组蛋白修饰是指在构成染色质的核心组蛋白尾巴上进行甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化等共价修饰。染色质的组蛋白修饰改变将直接影响染色质的结构并调控基因表达。Koche等[20]在研究重编程早期转录和表观修饰改变时发现，重编程早期染色体上有1000多个区域发生H3K4me2的组蛋白修饰，它们主要集中在多能性和发育调控相关基因的启动子和增强子上。

3.1组蛋白甲基转移酶与重编程进程组蛋白甲基转移酶中的两个重要家族PcG和TrxG是细胞分化和重编程过程中染色质结构改变的关键调节因子。PcG蛋白与基因沉默和异染色质稳定性相关，包括多梳抑制复合物1和多梳抑制复合物2。多梳抑制复合物2的两个亚单位Suz12和Eed使染色质标记H3K27me3，多梳抑制复合物1识别并结合到这些修饰区域，并促使抑制标记H2AK119ub形成[21]。TrxG则是在基因的启动子上维持转录活化的H3K4me3标记[22]。TrxG复合体的核心组分Wdr5在iPSCs的重编程过程中被激活，它能直接结合到多能性基因启动子上调控多能性基因转录，重编程中敲减Wdr5则使重编程效率的显著下降[23]。

H3K27去甲基化酶Utx和Jmjd3是重编程过程中不依赖PcG/TrxG的组蛋白修饰酶。Utx在重编程过程中能去除体细胞中H3K27me3，与OCT4、SOX2及KLF4(Kruppel-like factor 4)共同确定多能性状态[24]。Jmjd3能抑制iPSCs的重编程，可能与PHF20的泛素化相关。PHF20本身对于iPSCs的产生十分关键，并能与Wdr5相互作用调控基因表达[25]。

Onder等[26]通过shRNA研究重编程过程中的染色质修饰酶时，发现了一些影响重编程效率的染色质修饰酶，如敲减组蛋白修饰酶SUV39H1及DOT1L能使重编程效率提高1倍。对H3K79甲基转移酶DOT1L的进一步研究发现，抑制DOT1L能显著减少谱系特异基因上的H3K79me2水平，从而抑制其转录并提高重编程效率[26]。而使用小分子BIX-01294 抑制H3K9me甲基转移酶G9a也能促进iPSCs的产生[27]。

3.2组蛋白乙酰化与重编程密切相关组蛋白乙酰化是染色质转录活化区域的标记，主要是通过组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶调节。在ESCs多能性相关基因的启动子区域的组蛋白是高乙酰化的[28]。更重要的是，去乙酰化酶抑制剂能显著提高iPSCs重编程效率。在iPSC重编程的过程中使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸和曲古菌素A阻止组蛋白的去乙酰化提高iPSC的重编程效率[29]。而单独使用丙戊酸处理体细胞(未转重编程因子)也能使多能性基因表达上调[29]。精氨酸甲基转移酶抑制剂AMI-5和转化生长因子β抑制剂A-83-01能促进小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs的过程[30]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂Butyrate能使人成纤维细胞重编程效率提高50倍[31]。

4CRCs

CRCs能特异地结合到染色质上改变核小体的分布，进而改变染色质的结构，这是与DNA甲基化及组蛋白修饰不同的基因调控机制。ATP依赖的CRCs包括ISWI、染色质解旋酶DNA结合蛋白(chromodomain helicase DNA-binding protein，CHD)、INO80和SWI/SNF复合体4类。CRCs通常包括一个SWI2/SNF2 ATP酶结构域，一个染色质识别亚单位，及与其他蛋白结合的调控亚单位。

4.1SWI/SNF复合体协同多能性转录因子促进重编程进程SWI/SNF复合体在细胞分化和重编程过程中的关键作用可能是它能增强重编程因子结合到多能性相关基因启动子上而提高重编程效率。Brg1/Brm相关因子( Brg1/Brm associated factor，BAF)及PBAF复合体是SWI/SNF中的主要成员，至少由12个蛋白亚基组成。在不同的细胞中BAF或PBAF复合体的组成有差异，如在ESCs中BAF复合体包括Brg1、BAF60a、BAF155，而缺少Brm、BAF60c、BAF170[32]。过表达Brg1和BAF155能替代c-MYC,激活内源性的OCT4的表达并使体细胞完全重编程为多能性状态[33]。其机制是，BRG1和BAF155能提高多能性相关基因启动子上活化标记H3K4me3和H3K9ac的水平，并减低抑制标记H3K27me3的水平。Mak等[34]通过蛋白质相互作用研究发现，BRG1及BRM复合体与KLF4相互作用促进体细胞重编程为iPSCs。在第二代的小鼠成纤维细胞中过表达BRG1或BRM能使重编程效率提高2～7倍，而用shRNA对其进行敲减将使重编程效率下降50%以上[34]。

4.2CHD家族与重编程过程在CHD家族中发现有4个染色质重塑酶与多能性相关：CHD1、CHD3、CHD4和CHD7。在ESCs中进行的RNAi筛查实验发现,染色质重塑酶CHD1对于维持OCT4等多能性因子的表达发挥关键作用，同时也使其染色质维持一个开放的状态。在重编程过程中敲减CHD1能使重编程效率下降50%以上[35]。而CHD7对于ESCs向神经脊分化是必需的，其机制是通过与PBAF复合体相互作用而影响其向神经脊分化的[36]。CHD3和CHD4构成核小体重塑(NuRD)复合体的催化亚基，在ESCs中发挥作用。Mbd3是核小体重塑和去乙酰化酶复合体的核心单位，在iPSCs重编程过程中敲减Mbd3能使iPSCs重编程效率近乎达到100%[37]。

INO80和ISWI家族在ESCs中主要与多能性和自我更新相关，它们在重编程中的作用有待进一步的研究[38-39]。总之，以上对CRCs的研究将染色质修饰或结构的改变与多能性转录程序和体细胞的重编程、多能性干细胞的分化联系在一起。这不仅说明了CRCs在重编程和多能性中的重要作用，同时也提示其在多能性开放染色质维持、细胞分化中可能扮演更为重要而广泛的作用。

5结语

至今为止，iPSCs的重编程是依赖于转录因子结合到DNA上，从而能改变细胞命运。而这种改变细胞命运的方法依赖并被染色质的状态调控因子所促进。对普遍的转录机制相关组分的研究发现，它们不仅能影响重编程的效率，并且对于重编程过程十分关键。这暗示调控细胞重编程上存在不同层次的机制。随着细胞重编程方法变得越来越成熟和多样，对于重编程的生物学机制研究会变得更加快速和清晰。多能性细胞分化和重编程过程中动态表观遗传图谱的绘制也将提供细胞重编程中染色质水平上的作用机制。

目前对重编程过程中的染色质修饰因子研究主要集中在：①发现影响重编程的新的染色质修饰因子；②染色质修饰因子影响重编程的机制研究；③染色质修饰因子与转录因子在重编程中的相互作用对表观遗传和转录状态的影响。对iPSC重编程中染色质修饰因子的研究不仅加深了对重编程和细胞命运决定的了解，同时对于多能性干细胞定向诱导用于临床应用都有极大的促进作用。

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Research Progress of Chromatin Modifying Factors in Induced Pluripotent Stem Cells Reprogramming

WUXing-wu1,LINGe1,2,HULiang1,2.

(1.InstituteofReproductive&StemCellEngineering,CentralSouthUniversity,Changsha410000,China; 2.NationalEngineeringandResearchCenterofHumanStemCell,Changsha410000,China)

Abstract:Induced pluripotent stem cells(iPSCs) have wide application prospect in regeneration medicine because of its unique advantages.In recent years,a series of studies have discovered the chromatin modifying factors play indispensible roles both in stemness maintaining and somatic cell reprogramming process.In reprogramming process,inhibiting some chromatin modifying enzymes can improve the reprogramming efficiency,while knockdown or knockout of the chromatin modifying factors would result in retardation or failure of reprogramming process.Here is to make a review of the characteristics and mechanism of recently disco-vered chromatin modifying factors which play important roles in the process of iPSCs reprogramming.

Key words:Reprogramming; Chromatin modifying factors; Induced pluripotent stem cells

收稿日期：2014-05-19修回日期：2014-08-29编辑：伊姗

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81372627)；湖南省自然科学基金(13JJ3038)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.08.001

中图分类号：R394

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)08-1345-04