结核病实验室诊断研究新进展

吴艳华,王茂水(综述)，李　霞(审校)

(1.　山东省医学科学院基础医学研究所，济南 250062； 2.济南大学 山东省医学科学院医学与生命学院，济南 250200；

3.山东省胸科医院检验科，济南 250013)

结核病实验室诊断研究新进展

吴艳华1,2,3△,王茂水3(综述)，李霞1※(审校)

(1.山东省医学科学院基础医学研究所，济南 250062； 2.济南大学 山东省医学科学院医学与生命学院，济南 250200；

3.山东省胸科医院检验科，济南 250013)

摘要：随着分析技术的不断进步以及对结核杆菌致病机制研究的深入，结核病的实验诊断在分子标志物、结核抗体、核酸检测、γ干扰素释放试验和诊断模型等方面取得了很大的进步，极大丰富了结核病实验室诊断手段。这些实验手段的应用，为结核病的诊断提供了较好的选择方案。尽管如此，这些新手段仍仅作为辅助手段，不能完全替代涂片与培养等传统手段。因此，仍然有必要继续开展相关研究，以推动结核病的实验室诊断水平。随着分析技术的不断进步和结核病分子机制的深入探讨，相信会有更好的标志物或诊断手段进入临床并得以应用。

关键词：结核病；诊断；标志物；试验

结核病是目前最严重的传染病之一，依据世界卫生组织(WHO)2013年全球结核报告，2012年约有860万例新发结核病患者，约130万例患者死亡。随着艾滋病的流行与耐多药结核的出现，结核病的控制难度不断增加。长期以来，结核病实验室诊断手段依然依赖于涂片、培养等。这些方法往往具有阳性率低、耗时等缺点。为有效控制结核病，有必要寻找新标志物以及建立新型的结核病实验室诊断手段。现就近年分子标志物、结核抗体、核酸检测和干扰素γ释放试验等在结核病诊断中的新进展予以综述。

1诊断标志物

1.1结核抗原由于当前分析手段灵敏度与结核抗原含量低的问题，可用于诊断的结核抗原较少。新近发现，结核抗原Rv3803c和Rv2626c在诊断活动性肺结核方面具有极好的诊断价值[1]。目前研究较多的是结核杆菌的表面抗原脂质阿拉伯甘露聚糖，研究表明尿脂质阿拉伯甘露聚糖的检测可用于艾滋病患者并发结核病诊断，由于检查的无创性，极具前景[2]。研究表明，其灵敏度为13%～93%，特异度为87%～99%。另外，诱导痰脂质阿拉伯甘露聚糖的检测也有助于艾滋病患者并发结核病的诊断[3-4]。当前，基于尿液脂质阿拉伯甘露聚糖检测的即时检验试剂盒已上市，其在艾滋病并发结核病患者中的诊断价值被广泛评价，具有较好的前景。

1.2宿主反应相关蛋白结核杆菌侵入人体后，会与宿主之间产生相互作用，在此过程中机体会发生一系列免疫学改变，如细胞因子水平、急性时相蛋白的改变等，而这些改变可以作为结核病的诊断标志物。如胸腔积液白细胞介素27在诊断结核性胸腔积液方面具有较好的价值(灵敏度为92.7%，特异度为99.1%)[5]； 干扰素γ在诊断结核性腹膜炎方面也极具价值[受试者工作特征药时曲线下面积(AUC)为0.99][6]；血清C反应蛋白在结核病患者中的水平(中位数57.8 mg/L)远高于非结核患者(6.4 mg/L)，同时研究表明，当C反应蛋白水平≥50 mg/L，疾病预后较差，患者具有较高的结核杆菌负荷量、易播散和高死亡风险[7]；另有研究表明，血清人附睾上皮分泌蛋白4在区分肺癌与肺结核方面具有较好的灵敏度(61.6%)和特异度(93.0%)[8]。最近，有学者应用蛋白质谱技术研究活动性肺结核病患者的血清诊断标志物发现，纤维蛋白原在结核病患者中水平升高，提示其可用于结核病的诊断[9]。

1.3可挥发化合物结核感染后，机体在呼气时会产生特异的挥发性有机化合物，随着气质联用技术的进步，挥发性有机化合物检测成为可能[10]。通过检测萘、苯和烷烃等的衍生物含量，建立诊断模型，发现其在结核病诊断中的灵敏度为71.2%，特异度为72%，AUC为0.80[11]。

1.4微小核糖核酸近年来，随着对微RNA(micro RNA,miRNA)研究的不断深入，发现其在机体的免疫反应中具有重要作用。已有研究探索血清微小核糖核酸谱的变化，发现59个miRNA下调，33个miRNA上调，同时表明miRNA-29a可成为结核病诊断标志物[12]。另外，Yi等[13]还发现痰中微小核糖核酸谱也有改变。其他研究显示，血清miRNA-361-5p、miRNA-889和miRNA-576-3可以用于区分结核感染者与健康者或其他微生物感染者，这3种miRNA AUC介于0.711～0.848，而当三者联合时，AUC可提高至0.863[14]。miR-155*和miR-155也具有较好的诊断价值，其中miR-155的AUC为0.8972，miR-155*的AUC为0.7945，同时研究发现这两种分子标志物与结核抗原的表达密切相关，提示可能具有一定局限性[15]。

2结核抗体的研究进展

一项Meta分析显示，抗结核抗体检查具有较大的不稳定性，各种测试之间差异较大[16]。目前研究倾向于采用联合抗原检测抗结核抗体，这可有效避免个体之间抗原反应的异质性，而单抗原检测结核抗体时，各种抗原存在较大差异。如某研究评估18种结核抗原结核抗体检测，发现灵敏度为55.7%～82.9%，特异度为62.0%～92.2%，同时发现联合抗原检测有助于提高结核抗体检测性能[17]；又如某研究比较了4种脂酶(LipY、Rv0183、Rv1984c和Rv3452)用于结核抗体检测，灵敏度为73.4%～90.5%，特异度为93.9%～97.5%，Rv3452性能最佳[18]；某研究评估早期分泌靶抗原6、培养滤液蛋白、早期分泌靶抗原6分泌1系统底物蛋白C、14×103/38×103融合蛋白和早期分泌靶抗原6/14×103/38×103融合蛋白等结核抗原，发现灵敏度为69.4%～77.6%，特异度为78.4%～90.2%[19]；一项Meta分析发现,结核杆菌分泌的MPT64蛋白在结核抗体检测中具有较好应用价值[20]。Zhu等[21]研究表明，MPT64蛋白抗体检测灵敏度为64.4%，特异度为99.4%，AUC为0.819。

3核酸检测

结核杆菌核酸检测可分为定性与定量检测。定性，如多重聚合酶链反应和巢式聚合酶链反应；定量，如实时聚合酶链反应。这些方法在结核病诊断方面差异不大，均具有较好的灵敏度和特异度[22]。当前该技术的研究热点集中在靶点序列的选择以及多种聚合酶链反应技术的比较等方面。研究较多的靶点序列主要有插入序列6110(insertion sequence 6110,IS6110)、MPB64基因、参与编码L-丝氨酸脱氢酶的Rv0069c(L-serine dehydratase Rv0069c,sdaA)、Rv3133c、RNA聚合酶β亚基基因(β-subunit of RNA polymerase,rpoB)、热激蛋白65基因(heat-shock protein 65,hsp65)和16S 核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)等。

结核杆菌核酸检测技术具有较好的检测性能，如全血样本的多重聚合酶链反应检测技术(IS6110和MPB64)，其灵敏度为95.7%、特异度为100%[23]；聚合酶链反应检测sdaA序列，并与其他序列引物比较(如Rv3133c，IS6110，MPB64，rpoB)，sdaA聚合酶链反应的特异度为96.5%、灵敏度为95.9%，与其他引物相比，sdaA-聚合酶链反应具有一定优势[24]；巢式聚合酶链反应检测hsp65序列，灵敏度为100%(结核分枝杆菌培养阳性患者)和95.0%(抗酸杆菌涂片阳性患者)，特异度为93.1%[25]；多重聚合酶链反应(基于16SrRNA、IS6110和Rv3133c等序列)灵敏度为97.5%[26]。

评价较多的结核杆菌核酸检测试剂盒有：罗氏公司的Applicor法和TaqMan法试剂盒，Cepheid公司的GeneXpert(GX)系统。有研究比较Applicor法与TaqMan法，发现在呼吸道标本中TaqMan法要优于Applicor法，两者符合率达到98.2%[27]。在随后进行的前瞻性研究中，发现TaqMan法在呼吸道标本中灵敏度为88.4%、特异度为98.8%，在非呼吸道标本中，灵敏度为63.6%、特异度为94.6%[27]。另一研究也证实TaqMan法具有较好的性能，发现TaqMan实时定量聚合酶链反应法在呼吸道标本中的灵敏度为82.7%(结核分枝杆菌培养阳性患者)和34.9%(抗酸杆菌涂片阴性患者)，特异度为96.5%[28]。

GeneXpert MTB/RIF系统是一款基于实时定量聚合酶链反应技术的仪器，可用于结核杆菌检测和利福平耐药。一项Meta分析显示，该技术在结核病诊断方面具有较好的灵敏度和特异度[29]。它是一种准确度高、容易操作、快速的结核杆菌检测方法。如在活动性肺结核中，GeneXpert MTB/RIF系统的诊断灵敏度为79.5%、特异度为100.0%[30]。研究显示，GeneXpert MTB/RIF系统在结核性脑膜炎、生殖结核、淋巴结核、儿童肺结核等疾病中均有不错表现。该检测的样本来源广泛，如全血样本、纤维支气管镜样本、鼻咽拭子等。但在抗结核治疗评价方面，其具有一定局限性。

4干扰素γ释放试验

目前，基于干扰素γ释放原理的试剂盒有德国凯杰公司的全血干扰素γ释放试验试剂盒(QuantiFERON-TB Gold)和英国Oxford Immunotec公司的结核感染T细胞检测试剂盒(T-SPOT.TB)。两者原理相似，差异在于干扰素γ的检测方式不同，一种是检测干扰素γ的水平，一种是计数分泌干扰素γ的细胞数量。研究显示，两者在结核感染诊断方面性能相当，差异较小[31]。但是在结核感染高负担区域，干扰素γ释放试验并不准确，这是由于潜伏感染者，也会呈现阳性，该测试仅被批准用于结核感染的判断，而非活动性结核病，且证据并不支持其可以用于常规测试。尽管如此，干扰素γ释放试验还是展现了较好的应用前景。

比较结核菌素试验和全血干扰γ素释放试验在活动性肺结核中诊断价值时，发现全血干扰素γ释放试验的灵敏度为80%，而结核菌素试验的灵敏度为28%，表明全血干扰素γ释放试验与结核菌素试验相比，具有更好的灵敏度，且其不受卡介苗与非结核分枝杆菌的影响[32]。我国学者发现，在骨结核诊断方面，结核感染T细胞检测的灵敏度为94.2%，而涂片检查仅为19.7%，定量聚合酶链反应检查仅为36.8%，培养为34.2%[33]。提示与其他检查相比，结核感染T细胞检测更有助于骨结核的诊断。

5其他技术

5.1外周血淋巴细胞抗体分泌试验外周血淋巴细胞抗体分泌试验通过检测离体细胞分泌的特异度抗体，达到间接诊断病原体感染的目的。Raqib等[34]率先将该技术引入结核病诊断，并取得不错的研究结果。该法在活动性肺结核诊断中，灵敏度可达90%，特异度可达88%[35]。另外，该法在儿童结核病的诊断中也取得了不错的结果[36]。但是该法对非结核疾病组与结核病之间区分能力较差。

5.2预测模型目前，多项研究评价预测模型或赋分系统在结核病鉴别诊断中的应用均有较好的表现，如Neves等[37]提出的结核性胸腔积液的诊断模型，其特异度和灵敏度均可达到95%以上；Sun等[38]制作的赋分模型在鉴别结核性胸腔积液与非结核性胸腔积液方面，灵敏度可达90.1%，特异度为94.3%，准确度为92.1%；Soto等[39]制作的赋分模型在鉴别涂阴肺结核方面，AUC为0.83，具有更好的鉴别诊断价值。

6展望

随着分析手段的不断进步以及对结核病致病机制研究的不断深入，相信会有越来越多的标志物或者实验手段进入临床。这些标志物与诊断手段的总体发展趋势应该是简单、快速、廉价、准确。尽管现有的结核病实验室检测手段种类繁多，但是仍然没有哪一种手段可以替代涂片与培养，因此仍然有必要继续开展相关研究，寻找一种性价比更高的实验室诊断手段。

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Recent Research onLaboratoryDiagnosis of Tuberculosis

WUYan-hua1,2,3,WANGMao-shui3,LIXia1.

(1.InstituteofBasicMedicine,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China; 2.UniversityofJinan,ShandongAcademyofMedicalandLifeScience,Jinan250200,China; 3.DepartmentofLaboratoryMedicine,ShandongProvincialChestHospital,Jinan250013,China)

Abstract:With the advancement of analytical technology and development of pathogenesis in Mycobacterium tuberculosis(TB) infection,the TB laboratory diagnosis has made great progress in molecular markers,serological tests,nucleic acid amplification,IFN-γ release assays and diagnostic model in the past few years.Although these diagnostic methods have improved the level of TB diagnosis,it only can be used as an adjunct tool and cannot completely replace the traditional methods,such as smear and mycobacterial culture.Therefore,there is still a need to carry out research to promote the laboratory diagnosis of tuberculosis.In the future,under the help of analytical technology and mechanism of TB infection,it′s believed that more and more diagnostic methods will be introduced into clinical practice.

Key words:Tuberculosis; Diagnosis; Marker; Trial

收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-07-17编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.04.035

中图分类号：R446.9

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)04-0666-04