miR-487a在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

刘有黄，徐　锋，张征宇，葛京平，高建平，程　文

(南京军区南京总医院泌尿外科，南京 210002)

miR-487a在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

刘有黄，徐锋，张征宇，葛京平，高建平，程文※

(南京军区南京总医院泌尿外科，南京 210002)

摘要：目的探讨miRNA-487a在肾透明细胞癌(ccRCC)中的表达及临床意义。方法收集2011年1月至2012年12月在南京军区南京总医院泌尿外科手术切除的45例配对ccRCC组织及癌旁正常肾组织，常规提取45例新鲜ccRCC与癌旁组织中总RNA，应用荧光定量反转录-聚合酶链反应法检测标本中miRNA-487a的表达状况；分析miRNA-487a表达差异与临床病理特征间的关系。结果与癌旁组织(1.00)比较，miRNA-487a在ccRCC表达水平为(3.30±1.03)，明显上调 (P<0.05) 。miRNA-487a的表达在不同肿瘤浸润程度及Fuhrman分级间差异有统计学意义(P<0.05)，而与年龄、局部淋巴结转移和远处转移均无关(P>0.05)。结论miRNA-487a在肾透明细胞中表达上调，可能为促进ccRCC的发生、发展的因素之一。

关键词：肾透明细胞癌；微RNA-487a；微RNA

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是成年人中最常见的一种肾脏恶性肿瘤[1-2]，对化疗、放疗均不敏感，其发生、发展的分子机制至今仍不清楚，目前尚无明确的临床应用肿瘤标志物。研究证明，微RNA(microRNA，miRNA)与多种肿瘤的发生、发展密切相关[3]。研究显示，miRNA可能会成为一种潜在ccRCC的早期诊断、判断预后和靶向治疗的新途径[4-5]。迄今为止，miRNA在ccRCC中的功能研究较少，提示这一领域的研究仍处在早期探索阶段，有继续深入探索的巨大空间。本研究应用基因芯片技术检测ccRCC及癌旁组织中miRNA-487a表达，探讨其与ccRCC发生的关系，以期为阐明ccRCC发生的分子机制提供新的依据。

1资料与方法

1.1一般资料收集2011年1月至2012年12月在南京军区南京总医院泌尿外科手术切除的45例配对ccRCC组织及癌旁正常肾组织，所有病例均行肾癌根治术。患者男33例、女12例，年龄36～72岁，平均(47±5)岁；其中行根治性肾切除患者39例,肾部分切除术患者6例；按照世界卫生组织分类标准进行病理诊断:ccRCC 38例,肾乳头状细胞癌2例,肾嫌色细胞癌3例,其他类型2例；按照美国癌症联合会的TNM分期标准进行分期：其中T1期25例,T2期8例,T3期7例,T4期5例,N0期40例,N1期5例,M0期41例,M1期4例；按照Fuhrman Grade分级为1级12例,2级18例,3级9例,4级6例。

1.2方法取材后冲去污物，转存液氮中备用

1.2.1总RNA抽提及质量检测应用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)，按说明书要求提取总RNA。使用Nanodrop ND-1000测定RNA浓度并评估纯度，采用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.2.2miRNA芯片杂交采用miRCURYTMArray Power标记试剂盒(上海康成生物有限公司实验室提供)，按照说明书进行芯片杂交。杂交后取出芯片，用miRCURYTM Array清洗缓冲试剂盒洗片，芯片干燥后立即使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片，芯片图像的原始荧光强度数据由GenePix pro V6.0完成分析。

1.2.3荧光定量反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测miRNA-487a表达miRNA-487a及内参U6均按以下程序进行扩增：95 ℃，3 min；40个PCR循环(95 ℃，15 s；60℃，20 s；72 ℃，20 s；78 ℃，20 s(收集荧光)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按以下程序进行：95 ℃，2 min；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；99 ℃，15 s，并从72 ℃缓慢加热到99 ℃(8 min)。相应的PCR引物如下：U6正义链：5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，反义链：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，长度 89 bp；miRNA-487a正义链：5′GGGAATCATACAGGGACAT3′，反义 链： 5′TGCGTGTCGTGGAGTC 3′，长度62 bp。两者均按以下程序进行扩增：95 ℃，3 min；40个PCR循环[95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；78 ℃，20 s(收集荧光)]。

1.2.4PCR产物的定量校正和判定分析通过Light Cycler软件获得miRNA-487a的循环阈值(Ct值)，计算ΔCt值，ΔCt=miR-487a Ct值-U6 Ct值，以2 -ΔΔ Ct表示miR-487a的相对表达水平，按目的基因表达量=2-ΔΔ Ct公式计算各样本miRNA-487a的含量。

2结果

2.1RNA质量鉴定变性琼脂糖凝胶电泳后能观察到28 s、18 s、 5.8 s(5 s),提示所提取的RNA完整可用于后续实验。分光光度法提示A260/A280的值为1.90～2.0，A260/A230的值为1.89～2.28。

2.2RT-PCR验证结果miRNAs定量RT-PCR扩增曲线和溶解曲线，显示溶解曲线呈单峰引物，引物的特异性较好。见图1、图2。

2.3miRNA-487a在ccRCC中的表达及与肾癌临床病理特征的关系miRNA-487a在ccRCC和癌旁组织中的表达水平分别为(3.30±1.03)和1.00，差异有统计学意义(P<0.05)。miRNA-487a的表达与年龄、局部淋巴结转移和远处转移均无关(P>0.05)。miRNA-487a下调在T2~4期多于T1期、Fuhrman 分级3~4级多于1~2级(P<0.05)。见表1。

3讨论

miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的小分子非编码RNA，其大小长为20～25个核苷酸，miRNA与其靶mRNA的3′非编码区特异性结合而介导翻译水平的调控，调节了细胞生长、组织分化等一系列生命过程[6-7]。已有研究发现，miRNAs可充当癌基因、抑癌基因的角色，其表达与肺癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肝癌等多种癌症相关[8]。miRNAs参与肿瘤发生和进展，可作为肿瘤诊断、预后的指标及肿瘤治疗新的靶点。miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性，这种特异性表达在临床上将有助于对特定肿瘤的诊断、治疗及预后进行评估。miR-487a定位于14号染色体，在乳腺癌中表达上调，在喉鳞状细胞癌中下调[9]，而其在ccRCC恶性转化中的作用机制目前国内外报道少见。

本研究结果显示，miRNA-487a在ccRCC中高表达，提示miRNA-487a可能通过下调某抑癌基因的表达使正常的抑癌机制改变，从而导致肾细胞癌的发生。miR-487a在ccRCC组织中表达上调的机制目前较少见报道，但如DNA甲基化、组蛋白修饰失调等表观遗传学改变与ccRCC的发生和发展有

密切关系。池泽湃等[10]发现，miRNA-21在肾细胞癌组织中显著高表达，其可能在肾细胞癌的早期诊断、治疗、判断预后等方面具有重要意义。Shinmei等[11]提出，miRNA-155在ccRCC组织中低表达，可作为肾细胞癌预后标志物。Doberstein等[12]发现，在肾癌中miRNA-145表达下调，引起整合素-金属蛋白酶17的上调，从而导致肾癌的发生。miR-126在乳腺癌、肾癌组织中表达下调，可抑制乳腺癌的转移[13-14]。本研究结果亦显示，miR-487a在肾癌组织中的高表达与肾癌患者原发肿瘤的分期、Fuhrman分级差异有统计学意义，有助于临床选择治疗方案和估计预后。

本研究应用基因芯片技术检测ccRCC及癌旁组织中miRNA-487a表达，结果显示miRNA-487a在ccRCC中高表达，并经定量RT-PCR验证证实，微阵列基因芯片的检测结果准确可靠，提示miR-487a在肾癌组织中高表达，可能为促进ccRCC的发生、发展的因素之一。目前miRNA-487a调控肿瘤细胞的发病机制尚未明确，有待在后续实验中进一步研究。

参考文献

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更正说明：

《医学综述》2015年第17期第3256页“ⅢA期肺癌胸腔镜辅助小切口治疗后的疗效及生存分析”一文中的作者“李占新”更正为“李占欣”。2015年第23期第4356页“电视胸腔镜下肺癌切除后患者预后影响因素分析”一文中的作者“李占新”更正为“李占欣”。

The Expression and Clinical Significance of miRNA-487a in Clear Cell Renal Cell CarcinomaLIUYou-huang,XUFeng，ZHANGZheng-yu，GEJing-ping，GAOJian-ping，CHENGWen.(DepartmentofUrology,NanjingGeneralHospitalofPLANanjingMilitaryCommand，Nanjing210002，China)

Abstract：ObjectiveTo detect the expression and clinical significance of miRNA-487a in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC).MethodsccRCC and corresponding adjacent tissues of 45 patients admitted to the Department of Urology,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command from Jan.2011 to Dec.2012 were collected and the total RNA was extracted routinely.The miRNA-487a expression was detected by using fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction.The correlations of miRNA-487a expression with the clinicopathologic characteristics was analyzed.ResultsThe miRNA-487a expression level of ccRCC tissue was (3.30±1.03),which was significantly higher than the adjacent tissue(P<0.05).The expression of miRNA-487a had statistically significant difference between different invasion degrees and Fuhrman gradings(P<0.05),but showed no significant correlations with the patients′age,histological type of the tumor,lymph node metastasis and distal metastasis(P>0.05).ConclusionThe up-regulated expression level of miRNA-487a in ccRCC is correlated with invasion degree and Fuhrman grading,and it may participate in the pathogenesis and development of ccRCC.

Key words：Clear cell renal cell carcinoma; miRNA-487a; MicroRNA

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-05-25编辑：伊姗

基金项目：南京军区南京总医院院内课题(2012034)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.042

中图分类号：R737.14

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4536-03