长链非编码RNA在干细胞中的研究进展

蔡　慧，王　琪，叶小娟(综述)，高　勇※(审校)

(1.同济大学附属东方医院肿瘤科，上海 200120； 2.同济大学附属上海市肺科医院肺癌免疫实验室，上海 200433)

长链非编码RNA在干细胞中的研究进展

蔡慧1△，王琪2，叶小娟1(综述)，高勇1※(审校)

(1.同济大学附属东方医院肿瘤科，上海 200120； 2.同济大学附属上海市肺科医院肺癌免疫实验室，上海 200433)

摘要：长链非编码RNA(LncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸且不具有蛋白质编码功能的转录产物。早先，LncRNAs被认为不具有生物学功能，只是转录过程中的副产物。近年来，随着对LncRNAs 研究的不断深入，人们的观念正在发生改变。现已发现，LncRNAs参与细胞生长、分化、增殖、凋亡等多项生命活动，且与人类多种疾病密切相关。近年来有关LncRNAs与干细胞的研究正在引起人们的关注，这些研究提示LncRNAs参与多种干细胞自我更新和分化的调控。

关键词：长链非编码RNAs；干细胞；自我更新；分化；肿瘤

随着人类基因组计划的不断推进，人们发现90%以上的基因组DNA能转录成RNA，而其中不足2%编码蛋白质[1-2]，其余不能编码蛋白质的转录产物被称为非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)[3]。根据长度不同，ncRNAs可以分为短链ncRNAs和长链ncRNAs(long ncRNAs,LncRNAs)。LncRNAs 缺乏特异完整的开放阅读框，几乎不具有蛋白编码功能。近年来有研究报道LncRNA参与干细胞多种生物学特性的调控[4]。现将对LncRNAs在干细胞中的研究进展予以综述，重点剖析LncRNAs与干细胞自我更新和多向分化之间的关联。

1LncRNAs的概念

LncRNAs是一类长度通常大于200个核苷酸，缺少特异完整的开放阅读框，不具有或几乎不具有蛋白质编码功能的RNA，在总ncRNAs中占有相当大的比例。LncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，因其数量、种类、功能状况均不明确，且尚缺乏有效的研究手段，故又被称作基因组中的“暗物质”[5]。尽管这些RNA不能编码蛋白质，却能在基因表达的多个环节(包括表观遗传、转录调控以及转录后调控等)发挥调控作用。

2LncRNAs的结构、分类和功能

LncRNAs与mRNA相似，经过剪切，具有多聚腺苷酸(polyA)尾和启动子结构。LncRNAs具有较低的进化保守性，其在细胞中的表达水平也明显低于编码蛋白的RNAs。大约2/3的LncRNAs来源于基因之间的广大基因组区域，其余的则来源于与编码蛋白的基因重叠、反义或基因内区域。根据与编码蛋白基因的位置关系，LncRNAs大致分为正义(sense)、反义(antisense)、双向(bidirectional)、基因内(intronic)和基因间(intergenic)5种类型[6]。通过在不同组织和细胞中进行高通量的RNA测序实验发现LncRNAs的表达还具有明显的组织和细胞特异性[7-13]。近年来大量研究表明，LncRNAs 与许多细胞学功能有着密切的联系[14-17]。如LncRNA 可以作为短链ncRNAs的前体，形成微RNA以及内源小干扰RNA，还可以作为微RNA“分子海绵”，对有活性的微RNA产生长效的抑制作用[15]；在细胞亚结构以及蛋白复合物的形成过程中LncRNA发挥“脚手架”的作用[16]，可以将两个或两个以上的蛋白分子“绑和”形成复合物。简言之，LncRNAs可以通过与ncRNAs，mRNA，基因组DNA以及多种蛋白质相互作用在转录、转录后、翻译水平以及表观遗传等多个层面影响细胞的生命活动。

3LncRNAs与干细胞

干细胞是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的细胞。在一定条件下，它们能够分化成多种成熟的功能细胞。近年来关于LncRNAs在干细胞中的研究层出不穷。

3.1LncRNA与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs) ESCs通常是由早期胚胎内细胞团(如桑葚胚，囊胚)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养筛选出的一类多能干细胞，在体外具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力。最近研究已经证实LncRNAs在维持人类ESCs自我更新能力和多能性方面具有重要作用[17]。

Guttman等[14]最先对基因间的长链ncRNAs(large intergenic non-coding RNA，LincRNAs)在ESCs中的表达和功能做了一系列研究，RNA测序结果显示有226条LincRNAs在鼠ESCs中显著高表达。他们发现绝大多数的LincRNA(约93%)对ESCs中的基因表达有明显的调控作用，有26条LincRNAs 能够显著影响多能性调控因子Nanog的表达水平，表明LincRNAs在维持干细胞多能性以及抑制细胞分化中起到重要作用。他们还发现，有13条LincRNAs与ESCs内胚层的分化有关，7条与外胚层的分化有关，5条与神经外胚层分化相关，7条与中胚层的分化相关，2条与滋养外胚层的分化相关。这说明LincRNA在ESCs的种系特异性分化中发挥重要的调控作用。随后他们还研究了ESCs中的LincRNA是否受到多能性相关转录因子(Oct4,Sox2,Nanog,cMyc,nMyc,KLF4,ZFX,Smad and TCF30)的调控。结果发现有75%的LincRNA的启动子区域能与至少一条多能性转录因子相结合，说明这些LincRNAs是多能性相关转录因子的作用靶点。此外还发现有74条(30%)的LincRNAs与ESCs中重要的染色质修饰蛋白密切相关。

Dinger等[18]在鼠ESCs中发现了12条LncRNAs与转录因子Pou5f1、Nanog、Sox2的表达谱相似，这些转录因子在维持ESCs多能性状态中具有重要作用。随后运用染色质免疫沉淀(ChIP)以及抗-Pou5f1和抗-Nanog抗体进一步证实了这些LncRNAs确实与Pou5f1和Nanog相结合[19]。

Ng等[20]也发现了36条LncRNAs的表达谱与Oct4和Nanog相似，而Oct4和Nanog在ESCs中普遍高表达且在分化成熟的细胞中表达降低。LncRNAs表达谱芯片结果显示，在人类ESCs和神经前体细胞中有934条LncRNAs的表达有明显差异，其中有36条LncRNAs在神经前体细胞中显著下调。随后他们挑选了3条LncRNAs(ES1，ES2，ES3)做进一步的功能性研究，发现这3条LncRNA中任意一条被沉默以后，均会促使ESCs分化。RNA免疫沉淀实验发现，在细胞核内ES1和ES2与多梳基因家族成员SUZ12以及多能性调控因子SOX2密切相关。

Sheik Mohamed等[21]通过免疫沉淀反应，找到了一组与Oct4和Nanog结合的LncRNAs，并对这些RNAs做了后续的测序实验，随后干扰了这些LncRNAs的表达并观察了ESCs分化活动的变化，结果提示，有部分与Oct4和Nanog结合的LncRNAs具有调控Oct4和Nanog的作用。

这些研究表明，ESCs的多能性以及种系特异性分化受到LncRNA作用网络的严密调控，而这些LncRNAs中又有很大一部分受到ESCs内众多转录因子的调控。

3.2LncRNAs与诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs) 已经分化成熟的体细胞(如纤维母细胞、卵母细胞等)可以在OCT4、SOX2、 KLF4 (OSK)、c-myc等转录因子的诱导下，通过重编码形成与ESCs及其类似的一类多能干细胞，称为iPSCs[22-23]。这类干细胞具有多向分化的能力，可以分化成几乎所有的细胞类型。近年来关于iPSCs与LncRNAs 的研究也受到人们的广泛关注。

在绝大多数iPSCs中，LncRNA-Gtl2的表达常被抑制，Gtl2基因呈母系表达，且能抑制父系基因Dlk1的表达，后者与Gtl2处于同一个基因簇(Dlk1-Dio3)并参与胎儿生长的调控[24]。此外，定位于Dlk1-Dio3基因簇中的26条miRNAs在非四倍体互补态和四倍体互补态的iPSCs中也呈差异表达。iPSCs中Dlk1-Dio3基因簇的沉默可直接导致这些iPSCs的发育受到阻滞。

Loewer等[25]对iPSCs中LncRNAs的表达与ESCs进行了比较，发现 28条lncRNAs对生成iPSCs有选择性优势。随后他们又从中筛选出3条可以与多能性转录因子(Nanog,Oct4,Sox2)结合的LncRNAs(lncRNA-SFMBT2,lncRNAVLDLR和lncRNA-ROR)。lncRNA-ROR在iPSCs中显著高表达，并受到多能性转录因子(OCT4,SOX2和NANOG)的直接调控。进一步的研究显示，ROR被下调以后，可以明显抑制iPSCs的成球能力，而反之则能促进iPSCs的成球能力[25]。ROR还可以抑制p53的活性，这提示ROR之所以能够促进iPSCs的自我更新和分化，原因之一可能是它抑制了iPSCs的凋亡。

Wang等[26]对ROR的功能进行了更深入的研究，同样发现ROR在调节干细胞多能性方面起重要调控作用。由于LncRNAs 可以作为“分子海绵”对miRNA起竞争性抑制作用从而阻断这些miRNAs下游靶基因的功能，研究者随后就ROR是否可以作为miRNA“海绵”从而对Oct4和Nanog进行调控进行了验证。实验证明ROR可以降低体内环境中miR145的表达水平，从而阻断miR145对Oct4,Sox2和Nanog的依赖性抑制作用，促进了干细胞的分化[26]。

3.3lncRNAs与成体干细胞由于成体干细胞可以从人体各个不同的组织中分离获得，并具有分化成多种成熟细胞系的能力，所以被人们广泛应用于临床研究，相比于ESCs而言，这避免了许多伦理和法律的约束。

Zuo等[27]在间充质干细胞的成骨分化的研究中发现有116条LncRNAs在分化过程中呈差异性表达。另外，Kretz等[28]在研究中发现，LncRNA-ANCR在上皮细胞分化过程中表达量有所下降，它能够调节一系列基因的表达从而抑制上皮细胞的分化。Ramos等[29]研究表明，LncRNA-Six3os和Dix1as在神经干细胞中对胶质神经元种系特异性具有调节作用。此外，Yildirim等[30]证实了LncRNA-Xist在维持造血干细胞活性中占有不可或缺的地位。

Sun等[31]对体外培养的前脂肪细胞、棕色和白色脂肪细胞以及单个的成熟脂肪细胞进行RNA测序，结果显示有20条 LncRNA在脂肪形成的过程中呈上调趋势。随后利用RNA干扰技术进行进一步的研究发现，这些LncRNAs的表达沉默可以导致几乎所有的成熟脂肪细胞向前体脂肪细胞转变。此外，Pang等[32]研究表明，PU.1基因的反义LncRNA可以与PU.1基因的mRNA结合形成mRNA/LncRNA二聚体抑制PU.1的翻译，促进前脂肪细胞的分化成熟。

3.4LncRNAs与肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs) CSCs的概念最早是在19世纪60年代由Cohnheim提出的，研究者认为肿瘤的发生、发展是由于肿瘤中存在一类为数不多但具有干细胞特征的细胞[33]。近年来随着技术水平的提高(如流式细胞分析和细胞分选技术等的广泛应用)，以及各种动物模型的建立，CSCs的概念已经被越来越多的学者所认可并加以研究。CSCs具有干细胞的多种特征，包括自我更新和多向分化的潜能。它们可以促进肿瘤细胞的增殖、分裂，诱导肿瘤细胞的分化[34]。

最近的研究表明，在ESCs的分化中起到关键作用的信号通路(如OCT4,SOX2,KLF4和PcG等)在CSCs中同样处于激活状态[35-38]。同时有报道，OCT4、SOX2等信号通路受到LncRNAs 的调控[26]，并且LncRNAs与肿瘤的相关研究近年来受到广泛关注。这些信息提示LncRNAs与CSCs分化也极有可能存在重要的调控关系。

研究表明，多梳基因如PcG在调节ESCs的自我更新和分化过程中起关键作用，而多梳基因信号通路又与多种肿瘤有密不可分的联系[38]。有研究者推断，LncRNA有可能通过与多梳基因复合物相互作用，抑制CSCs分化的进行[38]。

先前已有多项研究证明有部分ncRNAs尤其是miRNAs在CSCs的调节中发挥重要作用。如Han等[39]在2010年报道了miR-29a可以调控早期的造血过程，并诱导急性髓细胞白血病的发生，其中重要的机制之一就是miR-29a可以通过影响多个肿瘤抑制基因和细胞周期蛋白的活性，导致骨髓祖细胞往白血病干细胞方向转变。Bitarte等[40]则发现miR-451可以调控CSCs的多种干细胞能力，包括自我更新，肿瘤形成以及耐药性。在细胞成球培养中，下调miR-451可以增加巨噬细胞移动因子和多能性转录因子SOX2的表达，使细胞获得自我更新和肿瘤形成的能力。巨噬细胞移动因子和SOX2同时又参与Wnt信号通路的激活，而Wnt信号通路对于结肠癌干细胞活性的维持是至关重要的[41]。这又进一步说明miR-451可以通过调控Wnt信号通路来影响干细胞活性。近期有学者提出LncRNAs在调节CSCs分化的过程中，其中可能的一个机制是作为“分子海绵”，对miRNAs产生长效的抑制作用，从而对CSCs的干细胞活性产生间接调控的作用。如Kallen等[42]最近的研究发现LncRNA-H19就可以作为Let-7 家族的miRNAs的“分子海绵”从而影响Let-7的多种生物学功能。而此前Yu等[43]已经证实Let-7是乳腺癌干细胞中重要的调控因子，分别通过影响RAS和高迁移率族蛋白A2来调控干细胞的自我更新和分化的能力。科学家们期待有更多的研究能够针对LncRNA作为“分子海绵”影响CSCs活性方面提供更多更有力的证据。

4结语

近年来，LncRNAs对干细胞的调控作用引起人们广泛关注[17]。LncRNAs对干细胞的自我更新及分化能力确有明显的调控作用。然而，现有研究绝大部分局限于分子水平，尚缺乏可靠的体内试验为这些结论提供更加强有力的支持。今后的研究除了要对LncRNAs在干细胞中的作用机制做更深入的探讨，动物体内实验也同样重要，这将为人们提供更强有利的证据以揭示LncRNAs在人类多种疾病中发挥的功能，使LncRNAs有望成为人们诊断疾病的重要分子标志物，并为疾病的治疗提供新的手段。

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Research Advances of Long-non Coding RNAs in Stem CellsCAIHui1,WANGQi2,YEXiao-juan1,GAOYong1. (1.DepartmentofOncology,EastHospital,TongjiUniversity,Shanghai200120,China; 2.DepartmentofLungCancerandImmunology,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:Long non-coding RNAs(LncRNAs) are a sort of non-protein-coding transcriptional products that are composed of more than 200 nucleotides.In the past,LncRNAs were thought as non-functional by-products of transcription,however,the notion is changing with increasing studies for LncRNAs function.It has been shown that LncRNAs are involved in the regulation of cell growth,differentiation,proliferation and apopatosis,and are associated with multiple human diseases.Recently，studies concerning LncRNAs and stem cells are attracting people′s attention,the results indicated that LncRNAs are involved in self-renew and differentiation of various stem cells.

Key words：Long non-coding RNAs; Stem cells; Self-renewal; Differentiation; Tumor

收稿日期：2015-03-24修回日期：2015-06-01编辑：相丹峰

基金项目：上海市医学重点专科建设(ZK2012A26);浦东新区卫生系统重点学科群建设(PWZxq2014-04);上海市浦东新区卫生系统领先人才培养计划(PWRL2013-02)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.005

中图分类号：R394

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)24-4429-04