慢性淋巴细胞白血病的遗传基础

刘宇宏，李晓勇(综述)，张王刚(审校)

(1.延安大学附属医院 a.血液免疫科,b.普外科，陕西 延安 716000; 2.西安交通大学医学院第二附属医院血液科,西安 710004)



慢性淋巴细胞白血病的遗传基础

刘宇宏1a，李晓勇1b(综述)，张王刚2※(审校)

(1.延安大学附属医院 a.血液免疫科,b.普外科，陕西 延安 716000; 2.西安交通大学医学院第二附属医院血液科,西安 710004)

摘要：慢性淋巴细胞白血病(CLL)首次提出疾病中体细胞突变和甲基化改变。这个观点总结了本领域的最新发现和对肿瘤影响。从患者仅有的10%～15%基因突变到低频率相对大范围基因突变，基因组的研究揭示了疾病显著的分子异质性。NOTCH1和SF3B1突变启动了疾病进展。广泛的基因组研究显示CLL转变和增强子区大范围低甲基化有关。这种表观遗传学程序保留了原始和记忆B细胞起源假设。CLL表观遗传学和基因组研究为更多个体化诊断和潜在治疗靶点提供了新的前景。

关键词：慢性淋巴细胞白血病；DNA甲基化；基因突变

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是免疫功能缺陷的B淋巴细胞恶性增殖性疾病，它的特点是富有单克隆CD5+B 细胞和多样化的临床进展[1-2]。CLL分为两类，不同的临床特点主要与uCLL(无IgVH突变)和mCLL (有IgVH突变)相关，这两个亚型根据体细胞在免疫球蛋白重链可变区数量的增减而分。尤其伴有11q22~q23和17p13缺失等染色体的改变和疾病的不良预后有关，但是，13q14的缺失往往伴有疾病好的预后[3]。突变基因在不同路径聚集，包括NOTCH1信号路径及RNA剪接，先天炎症反应，DNA损害和细胞周期调控涉及的信号路径，最终启动疾病进展。另外基因组的变化，癌细胞显示表观遗传修饰密码的改变。这些机制包括：DNA甲基化，组蛋白乙酰化，核染色质的可取性，通过非编码RNAs的基因调控[4]。和其他白血病相似，CLL显示诸如肿瘤抑制因子启动子区高甲基化导致基因沉默[5]。相对遗传修饰，CLL表观遗传学改变的临床影响还没有很好的建立。

1CLL的细胞起源

CLL的细胞起源假设是有争论的。免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因体细胞突变差异，序列组成，B细胞受体反应性反映了CLL在B细胞的不同成熟阶段，缺乏重要的体细胞IgVH突变uCLL和存在IgVH体细胞突变mCLL[6]。基因表达的分析研究已经证实了uCLL和mCLL有较小的差异，这表明两者的亚型起源于单个细胞(比如经典抗原，记忆B细胞)[7]。在全基因组的表观遗传学研究已经证实，分析uCLL和mCLL DNA甲基化差异有助于理解不同B细胞亚群的相似性。尤其是uCLL与幼稚B细胞(IgD+和CD27-)和CD5+成熟B细胞生发中心(CD5+,IgD+，CD27+)相似，然而，mCLL和类别转换的记忆B细胞(IgM/D+IgA/G+,CD27+)更相似。有趣的是，这项研究证实了第三组CLL起源于B细胞，比如，经典抗原、独立B细胞生发中心均是从低水平的体细胞高突变获得[6]。

Seifert等[8]研究提出通过详细的CLL转录分析和来自外周血及脾脏多样化B细胞亚型确认uCLL和mCLL细胞起源。Seifert等[8]也检测了CD5+前体生发中心成熟B细胞(CD5+和CD27+)作为uCLL起源，却没有意识到CD5+后原始中心B细胞亚型(CD5+和CD27+)极可能是mCLL的起源。另外，在uCLL和mCLL中，IgVH突变阶段、基因重组、传统模型和两个正常CD5+B细胞亚群相似。

CLL最初获得于造血干细胞阶段。Kikushige等[9]观察了异基因移植的CLL患者，CLL表型克隆起源缺少VDJ基因重排。这次发现表明造血干细胞移植的CLL患者携带早期的遗传改变，接触了抗原的造血干细胞进一步分化，带来了CLL的发展过程。尽管这项发现和CLL的病因机制和治疗前景相关，但有效性还需进一步研究。

2CLL白血病突变现象

2012年起，CLL的几个全基因组序列和多于200个外显子已经贯穿了人们对疾病的理解[10]。这项研究揭示了标记分子的异质性，在10%～15%病例中仅有2%～5%的基因突变。且大约1/3病例突变是不可逆的[11]。大部分突变基因聚集在少部分路径中，解释了uCLL和mCLL亚型的差异。NOTCH1信号通路(NOTCH1和FBXW7)，mRNA剪接，加工和运输SF3B1,U2AF2,SFRS1,XPO1及 DDX3X。在uCLL中，DNA损害路径(ATM,TP53和POT1)是普遍的。在mCLL中，先天性炎症通路(MYD88,TLR2和MAPK1)占主要作用[10]。这种现象表明了两种CLL亚型的不同临床表现与各种下调分子机制有关。

CLL分子机制异质性着重于两大类外显子不同的突变分布研究。在Quesada等[11]研究105例CLL患者，大部分共同的突变基因是NOTCH1(12%) 和 SF3B1(10%)，接下来是POT1(5%)，CHD2(5%)和LRP1B(5%)。Wang等[10]研究91例患者中，最多的突变基因是TP53(15%)，SF3B1(15%)，MYD88(10%)和ATM(9%)。在后期研究中，仅有4%病例存在NOTCH1突变，TTP53 和ATM 突变分别为1%和4%。在这两项研究中，患者的临床特征有明显的差异。在Quesada研究集中在疾病早期阶段，包括诊断的或尚未治疗的，而Wang研究集中在相对年轻的患者(中位年龄54岁比62岁)，很高比例的患者有相反预后参数(两者比例为 21% 比8%,不利的细胞突变为43%比15%,高表达 ZAP70为46 %比29%)。这些发现表明了不同研究中突变基因的分布反映了CLL先天分子的异质性和患者的临床特征。但是，它不能被排除研究中部分差异是应用高通量测序导致的。

尤其是来源于整个基因组的数据序列研究使人们看清肿瘤突变现象的机制。核苷酸不同的置换在不同的癌症类型中是有区别的，也许反映了诸如暴露在射线，烟草致癌物环境下特殊的突变机制[12-14]。在发展过程中，CLL的这两类分子亚型暴露在不同的免疫微环境中，也就是说，mCLL从IgHV基因获得突变是在原始生发中心，而uCLL缺乏这些突变。在mCLL基因突变中，携带有胞苷脱氨酶诱导活化的体细胞高度突变产生的标记[15]。另外，Pente等[15]观察了mCLL比未突变IgVH有显著的高比例A>C/T>G突变。突变标记显然是由DNA聚合酶导致的，当DNA修复后是可恢复的。DNA聚合酶高表达在滤泡生发中心细胞，易导致胞苷脱氨酶的错误行为，造成免疫球蛋白基因多样性。DNA聚合酶无需转录但可以影响整个基因组。因此，在mCLL和uCLL中观察到，生发中心免疫微环境可有A>C这样的标记，反映了两类CLL亚型不同的细胞起源是有差异的[15]。

3CLL的DNA甲基化

CLL基因组特征，尤其是DNA甲基化序列已经得到研究，在少部分病例和正常B细胞亚型以及上百例高密度和以启动子为基础的基因芯片进行全基因组亚硫酸氢盐测序技术和简化的亚硫酸氢盐测序[16]。这些报道已经证实了在CLL及不同预后的CLL亚型中的个别基因，微小RNA，表观修饰路径的下调[17]。在uCLL和mCLL中，不同差异表达的基因，比如LPL、ZAP70、CRY1、SPG20、CLLU1或LAG1，在两种亚型的疾病中显示不同的甲基化模式，这显然与假定的细胞起源有关[17]。

除了个别基因，研究已经揭示大量CpG位点的表观调控，大部分形式为低甲基化。尤其是全基因组亚硫酸氢盐测序技术证实在uCLL和幼稚B细胞中，有3.79亿CpG位点甲基化差异，在mCLL和记忆B细胞中，有1.84亿CpG位点甲基化差异[18]。整体分析这些数据可揭示基因调控的机制。尽管报道CLL低甲基化经常影响DNA复制[19]，但缺乏甲基化会伴随增强子区的不均衡。DNA甲基化的全面分析和一系列CLL的基因表达检测到了仅5%～10%的基因显示有意义的关联。观察到基因体不同甲基化能双向调整基因表达，进一步证实了启动子区域基因表达水平和DNA甲基化的负相关[18]。另外，基因甲基化和不同启动子应用相关连，比如RB1基因，CD45和BCL2L1基因亚基选择性剪接[18]。

在原始B细胞和记忆B细胞可以获得不同水平的表观基因组重排而分别产生uCLL和mCLL。基因芯片分析显示在各自的细胞起源上，uCLL有多于mCLL几倍的甲基化改变。这些发现阐明了尽管起源于B细胞不同成熟阶段，CLL的两个亚型为什么会具有相似的基因表达和表型特征。尤其，原始B细胞转换uCLL发生2/3DNA甲基化改变，可检测到进入记忆B细胞生理区别。另外，CLL基因低甲基化和B细胞信号转导路，T细胞共刺激，细胞因子相互作用相联系，影响幼稚B细胞到uCLL的发展[18]。

总之，CLL的DNA甲基化较复杂，包括启动子区改变、启动子内的改变、选择性剪接、增强子DNA甲基化模式的高频改变。在DNA甲基化和基因表达水平上仅有小部分基因显示关联。因此，这些发现明显表明基因调控并不主要是DNA 甲基化。假如在CLL临床检测前的多阶段发展致癌过程中，DNA 甲基化起作用，那么，DNA甲基化就可负责CLL的发展中基因表达的历史改变。这包括细胞起源及所有活化阶段表观遗传学最终使肿瘤克隆发展成为CLL。

4CLL表观遗传学的临床影响

CLL最初的表观遗传学研究提供了可供临床参考的资料。无IgVH突变的CLL细胞中，NOTCH1和SF3B1突变更普遍，在早期的临床阶段高表达ZAP70和CD38[15,20-22]。在11q缺失的CLL，SF3B1突变频率更高[10]。NOTCH1突变与12号染色体三体相关[23]，这些基因的改变和临床不良预后有关。携有NOTCH1突变的CLL比有野生型NOTCH1表达的CLL更易进展为弥漫大B细胞淋巴瘤[15,20-22]。NOTCH1和SF3B1突变带来了患者不良预后，但尚不明确它们是否独立于IgVH的突变阶段[20-22]。

近年的研究显示，其他突变率低的基因关联性。363例患者，3%出现MYD88突变，主要是年轻和有利生物学特征，比如低水平表达ZAP70和CD38及有IgVH 突变的患者[15]。在对化疗耐受的CLL患者，更易出现BIRC3突变[24]。127例CLL患者，3.5%出现POT1突变，POT1突变增加了末端着丝粒的脆性和染色体的异常，未突变的IgHV和ZAP70高表达出现在重病期[25]。研究105例CLL患者，有4%产生蔗糖酶突变。这些突变的结果导致酶作用缺失，CLL转录组分析显示了重要的新陈代谢路径模式的变化[26]，符合CLL细胞其他新陈代谢变化的观察结果[27]。相对CLL高频低数量的基因突变，表观遗传学研究显示与正常细胞相比，肿瘤细胞内有数千基因的表观遗传学改变。单个基因，比如ZAP70[28-29]的预后影响已经证实了表观遗传的复杂性和uCLL或mCLL相关。最近的研究描述了ZAP70基因整体甲基化水平中单个CpG岛与CLL的临床表现相关[28]。Kulis等[18]应用1649个CpGs甲基化位点与假定的正常细胞起源相关，证实了以下三型CLL：幼稚细胞型预后差，记忆细胞型预后相对好，中间型有中等程度预后。这一发现，如果验证在独立的体系中，也许可以作为新的策略分类CLL患者。

5结语

在最初的表观遗传学研究中突出了分子的复杂性和疾病的异质性。高表达的基因和路径的改变带来了不同分组患者的生物学行为。不同突变的靶基因成为治疗的目的基因。然而这些发现的临床意义尚未完全理解。突变基因的低频率水平增加了作用关联的证据，在一批疾病分子异质性患者中的驱动突变的事实尚未完全清楚[30]。这种复杂性使表观遗传信息转变为临床疾病成为真正的挑战。新的诊断方法需要完整的基因组和有临床数据的表观遗传信息。这种观点将允许有更多的个体化的分子诊断，根据疾病生物危险度分层患者，确定更有效的治疗方案。

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Genetic and Epigenetic Basis of Chronic Lymphocytic LeukemiaLIUYu-hong1a，LiXiao-yong1b,ZHANGWang-gang2.(1a.DepartmentofHematology,1b.DepartmentofSurgery,theAffiliatedHospitalofYan′anUniversity,Yan′an716000,China; 2.DepartmentofHematology,theSecondAffiliatedHospital,MedicineSchoolofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

Abstract：Chronic lymphocytic leukemia(CLL) has provided the first comprehensive view of somatic mutations and methylation changes in this disease,which summarizes the recent findings in this field and the impact on neoplasm.Genomic studies have revealed a remarkable molecular heterogeneity of the disease,with only few genes mutated in up to 10%-15% of the patients and a relatively large number of genes recurrently mutated at low frequency.NOTCH1 and SF3B1 mutations are emerging as new drivers of aggressive forms of the disease.Genome-wide methylation studies have shown that CLL transformation is associated with a massive hypomethylation phenomenon frequently affecting the enhancer regions.This epigenetic reprogramming maintains an imprint of the putative cell of origin from naive and memory B-cells.Genomic and epigenomic studies of CLL are reshaping our understanding of the disease and provide new perspective for a more individualized diagnosis and new potential therapeutic targets.

Key words：Chronic lymphocytic leukemia; DNA methylation; Gene mutation

收稿日期：2014-08-11修回日期：2015-01-12编辑：相丹峰

基金项目：陕西省教育厅科研项目(14JK1823)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.010

中图分类号：R733.72

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)13-2329-04