植物黄酮分离纯化研究进展

方美蓉，刘海军，刘可越

(九江学院，江西 九江 332000)



植物黄酮分离纯化研究进展

方美蓉，刘海军，刘可越*

(九江学院，江西 九江 332000)

综述了植物黄酮分离纯化的常用方法，包括传统柱层析(薄层层析)法、 金属离子络合法、 膜分离法、高效毛细管电泳法、高效液相色谱法、高效逆流色谱法、高速离心分离技术、 聚酰胺树脂法以及大孔吸附树脂法。简要分析了各方法的优缺点和应用前景，为进一步深入研究植物黄酮的分离纯化提供参考。

植物黄酮；分离；纯化；研究进展

黄酮类化合物是一类存在于自然界中具有2-苯基色原酮结构的化合物。绝大部分植物都含有黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶、抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用[1]。其由2个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子互相连接而成的，常含酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团，提取方法常采用有机溶剂提取法(甲醇、乙醇)、超声辅助双水相萃取法；纯化常采用柱层析法、色谱法及大孔吸附树脂法。本文就黄酮类化合物的分离纯化方法进行介绍。

1 传统柱层析法

柱层析法具有分离效果好、操作简单等优点，是一种传统的分离方法。余丹妮等[2]为建立益母草总黄酮含量测定方法，在运用聚酰胺柱分离纯化样品后，以三氯化铝试剂为显色剂，芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定芦丁在412nm波长处的吸光度，并绘制出标准曲线，发现芦丁在4.8～29.0μg/mL范围内与吸光度有良好线性关系,r=0.999 6,回收实验中，平均回收率为102%,RSD=3%。由此得出结论：柱层析—分光光度法操作简单，准确可靠，可作为益母草药材的含量测定方法。现今较少使用此类方法进行黄酮的纯化，而多见于其优化工艺。李欣欣等[3]通过使用戊二醛交联胶原纤维吸附剂(CFA)，对两种结构相近的单糖基黄酮苷类化合物(染料木苷和黄芪苷)进行柱层析，并测定此种吸附剂的分离性能，发现改变乙醇水溶液的溶度可调节CFA对染料木苷和黄芪苷的吸附选择性：CFA的用量为6g，层析柱的径比为10∶1时，100%、 90%和70%乙醇水溶液进行分步洗脱，两者可分离，纯度分别为98%、97%。此方法操作简单，但洗脱过程繁琐耗时，尤其是使用硅胶层析柱时要避免金属离子干扰。

2 金属离子络合纯化法

此方法是利用黄酮类化合物具有超离域度，即黄酮类化合物的母核是由 3 个环组成，2个苯环，1个吡喃环，大多数含有羟基或羰基，此结构具有超离域度[4]，整个分子为一个大π键共轭体系,氧原子具强配位能力，与金属离子及稀土元素形成配合物后，再由解络合剂达到纯化目的。随着对它研究的深入，发现此类方法用于黄酮的纯化简便且有效。董艳辉[5]研究了金属络合法纯化火炭母黄酮的工艺，通过单因素实验对 4 种不同金属盐与火炭母黄酮的络合效果进行了比较，筛选出最佳络合金属盐为氯化钙，同时在反应液的pH为8.0、氯化钙溶液浓度为6.0mmol/L、黄酮浓度为0.2mg/mL、解络剂EDTA与络合剂CaCl2的摩尔比为1.5∶1的纯化条件下，黄酮含量由粗提物的20.5%提高到56.5%，提高了2.8倍。由此证明此法纯化火炭母黄酮简便有效。此类方法主要适用于含邻二羟基结构的黄酮类化合物的分离纯化，专属性强，但其解络合比较困难。

3 膜分离法

膜分离技术是一种利用待分离物中各物质分子量的大小不同，膜的选择渗透性作用，在压力差推动下分离纯化的方法。它是一种工艺简单，纯化效率较高的方法，主要用于分子大小差别较大黄酮类物质的纯化，易克传等[6]运用此法以菊花总黄酮纯度和操作过程稳定性为评价指标研究纯化菊花总黄酮工艺，采用膜分离技术对菊花提取液进行处理，对膜的规格、溶液温度、操作压力和操作时间进行了优选，得最佳工艺参数下：陶瓷膜，孔径0.5μm，溶液温度50℃、操作压力0.25MPa;超滤膜，截留分子量为8×103，溶液温度40℃、操作压力1.60MPa总黄酮纯度达19.8%。同时采用陶瓷膜进行微滤预处理，去除了大量大分子物质，减轻了浓差极化和凝胶层阻隔作用，超滤过程较为稳定。由这两项得出结论：采用膜技术纯化菊花总黄酮工艺操作简单，纯化效果好。此类方法特别适用于热敏性化合物，具有节能等特点，但对于分子量相差不大、结构相似的黄酮类化合物不适用。

4 高效毛细管电泳

高效毛细管电泳法是一种在电场驱动下,以毛细管为分离通道按待分离物分配系数的不同而进行液相分离的技术。其在分析、分离等方面的应用相比其他色谱方法更有优势，如高灵敏度、高速、样品耗用量少、重现性好、自动化等，这对长期生长于强辐射、日照时间长的环境下，具有有效成分含量高、生物活性强等优势的我国特有的高原植物西北中藏药中黄酮类化合物的分析研究具有重要意义[7]。此类方法分离效能高，分离速度快，但对仪器要求高，不适用于大规模生产的黄酮类化合物的分离纯化。周一鸣[8]等为建立一种高效毛细管电泳(HPCE)法测定黄酮类化合物含量的方法，以荞麦芽粉为原料，通过预试验，确定在20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)电泳缓冲液中，25℃、20kV 压力条件下进行电泳，在245nm 波长处同时检测分离的槲皮素和芦丁方法，发现所测结果与被测物质质量浓度呈良好线性关系，在10min 内黄酮类化合物完全分离， 符合定性研究和定量测定的要求，由此建立测定荞麦芽粉中芦丁、槲皮素黄酮类化合物含量的高效毛细管电泳法，为实现快速、准确测定植物样品中黄酮类化合物含量提供了一种新方法。

5 高效液相色谱法

早期，此方法较纸色谱、柱色谱、薄层色谱的分离效果更理想,但考虑到其分离成本较高,更多用于黄酮类化合物的定性检测、定量分析或少量样品的制备等[9]。彭礼军等[10]以天麻提取物为原料，采用硅胶柱层析和制备型高效液相色谱建立了分离纯化天麻素单体的制备工艺。先用柱层析对原料进行纯化得天麻素粗品，再进行分析型高效液相色谱考察流动相的组成、流速和上样量等对分离效果进行考察，通过将分析型高效液相色谱条件线性放大，确定制备型高效液相色谱条件：流动相为乙腈—水5∶95( V/V) ，流速为15mL/min，上样量为45mg，结果发现天麻素纯度达到99%以上。最后得出结论：较之目前常用的天麻素纯化方法，本研究方法能较方便地制备出高纯度(99% 以上)天麻素，但因本方法难以实现产业化应用且在实验过程中出现天麻素不稳定的现象，所以有待进一步研究。此类方法分离效能好，但成本较高，所以不常用于分离纯化。

6 高速逆流色谱法

高速逆流色谱( HSCCC) 是一种无需载体或固体支撑物，利用待分离物分配系数差异的液-液分配色谱分离方法，常用于天然药物的分离纯化。尹鹭等[11]应用高效逆流色谱法分离纯化了化橘红中2种黄酮类化合物：运用高效逆流色谱分析柱分离纯化，发现以乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶4∶5，V/V)为两相溶剂系统，可从1g粗提物中1次分离得到纯度大于98%的柚皮苷单体83.3mg。以二氯甲烷-甲醇-水(10∶7∶4，V/V)和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1，V/V)为溶剂系统，可从1g粗提物的酸解物中经2次分离得到纯度大于98%的柚皮素单体27.5mg，且两种物质分离时间均在60min内，从而得出结论该法简便、快速、制备量大，可用于化橘红中黄酮类化合物的快速分离制备。此类方法因未使用固体载体，避免了色谱中的不可逆吸附，可较好分离出天然药物中的单体，并达到较高纯度，所以对仪器要求高。

7 高速离心分离技术

高速离心分离技术是在离心机高速运转产生的离心力下,利用待分离物与周围介质密度差异使物质沉降或悬浮而达到分离的目的。此法尤其适用于固液相的分离，也是工业化生产的理想选择，同时因为物理方法的运用，也就避免了化学吸附带来的有效成分损失。潘廖明[12]通过正交试验优化离心法纯化大豆异黄酮的条件:大豆异黄酮样液浓度为20mg/mL,溶解温度为40℃,离心速度为2×103r/min,离心时间为30min的优化条件下,大豆异黄酮含量可由40.9%提高到71.2%,达到了进一步提高大豆异黄酮含量,满足其精细化需要的目的。此类方法主要依据化合物分子大小差异达到分离的目的，所以对于小分子化合物不适用。

8 聚酰胺树脂纯化法

聚酰胺树脂纯化法是利用聚酰胺树脂中的酰胺基与黄酮类化合物中的羟基通过氢键结合，由洗脱剂洗脱达到分离纯化的目的。近年来，聚酰胺树脂已广泛应用于中药及其复方有效部位或有效成分的分离纯化，且对黄酮类、酚类、醌类等成分的纯化比其他方法优越，具有可逆、分离效果好等特点[13]。司建志等[14]在用聚酰胺树脂纯化八角渣黄酮试验中，先通过静态解吸附实验，确定了纯化八角残渣黄酮的聚酰胺树脂目数：30～60目，然后采用单因素与正交实验优化吸附条件，动态解析实验优化解析条件,在最佳工艺：上柱液浓度为0.05g/mL(生药量)，上柱液pH为5，层析柱高度与内径的比值为12∶1，上柱液流速为1～2BV/h，饱和吸附量为150.06mg/g。4BV体积的90%乙醇冲洗树脂柱，解析率为70.77%物质中黄酮的纯度达87.5% 。以聚酰胺树脂对八角残渣黄酮的吸附量及解析率为指标证明聚酰胺树脂能有效纯化八角渣黄酮，且最终所得的黄酮纯度高，适于工业化生产。此类方法专属性较强，可与黄酮类化合物形成可逆吸附，但其吸附过程易受溶剂影响。

9 大孔吸附树脂纯化法

大孔吸附树脂法是利用吸附树脂对物质吸附差异，运用解吸剂进行纯化的方法，也是一种适合大规模生产的方法。最近研究多集中于从多种树脂中选出最适大孔树脂对含黄酮植物进行纯化。莫天录等[15]通过比较 10 种大孔吸附树脂纯化黄酮粗提取物的吸附及解吸性能，筛选出纯化XDA-1树脂并进一步考察了XDA-1树脂对黄酮粗提取物的静态、动态吸附与解吸的性能，得到XDA-1 树脂纯化绿茄叶黄酮粗提取的最佳工艺参数:吸附平衡时间8h，吸附浓度为2.00mg/mL，pH值3.0，温度25℃,上样流速2BV/h;解吸平衡时间2h，解吸剂乙醇的体积分数为80%，pH值3.0，解吸流速3BV/h。此条件下的纯化物浸膏中黄酮质量浓度为5.68mg/mL，纯化倍数为2.37。证实大孔吸附树脂纯化绿茄叶黄酮方法简单可行，为绿茄叶黄酮的分离纯化提供了实验依据。此类方法具有操作简便、理化性质稳定、不溶于酸碱及有机溶剂中、能较好保持化合物原本活性以及对有机物有较好选择性等优点，但在使用时其分离效能受吸附剂性能、洗脱剂种类、温度等的影响。

植物黄酮具有较多生理作用，所以有较多对它的分离纯化研究方法，且日益成熟并在不断完善。目前研究主要集中在现有方法基础上，对它的工艺条件优化；对色谱法中吸附材料的优选；对两种提取分离方法的合并联用，预期提高纯化效率。在后来的不断研究中，通过新的有机分子材料发现，仪器的更新，以及某类药物专有方法的使用，黄酮的分离纯化可以达到更高的效率。对于一些正在发展中的方法如高速逆流色谱法、大孔吸附树脂法以及高效毛细管电泳法具有纯化纯度高、杂质少等优点，具有很好的研究应用前景。

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[11] 尹鹭,曹学丽,徐静,等.高效逆流色谱分离化橘红中黄酮类化合物及组分结构鉴定[J].食品科学,2013,34(20):268-272.

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[15] 莫天录,薛林贵,高慧,等.大孔吸附树脂纯化绿茄叶黄酮的工艺研究[J].天然产物研究与开发,2015,27(3):534-539.

(责任编辑：宋勇刚)

2015-09-24

江西省科技支撑计划项目(20141BBG70084)；江西省自然科学基金项目(20122BAB205074)

方美蓉(1993-)，女，九江学院在读生，研究方向为中药天然产物。

刘可越(1978-)，女，博士，九江学院教授，研究方向为中药药效物质基础。E-mail：liukeyue2011@126.com

R282.71

A

1673-2197(2015)21-0061-02

10.11954/ytctyy.201521026