基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物学基础

陈申秒，吴雪莉

（1.山东滨州沃华生物工程有限公司山东滨州256600；2.山东博莱威生物技术研究所山东滨州256606；3.南京农业大学草业学院江苏南京210095）

基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫及生物学基础

陈申秒1，2，吴雪莉3

（1.山东滨州沃华生物工程有限公司山东滨州256600；2.山东博莱威生物技术研究所山东滨州256606；3.南京农业大学草业学院江苏南京210095）

基因Ⅶ型新城疫已成为我国禽业养殖中的主要新城疫类别，在商品肉鸡和蛋鸡养殖临床中成为防治重点，本文从基因Ⅶ型新城疫病毒的分子生物学基础上进行分析，结合生产实践，为养殖一线制定切实可行的防治措施提供比较有价值的参考。

基因Ⅶ型；新城疫病毒；分子生物学

鸡新城疫病毒(New castle disease virus,NDV)属于副黏病毒科，腮腺炎病毒属的单股负链RNA病毒，是危害养禽业最重要的传染性病毒之一，被OIE列为A类疫病。受养殖环境、免疫压力和生物安全措施等各种因素的影响，鸡新城疫病毒成为最常见，同时也是防控难度最大、问题最多的疫病之一。全世界曾多次发生新城疫的大流行，研究认为目前处于NDV的第四次大流行期，流行病学研究证实本次流行是由基因Ⅶ型NDV引起的，在亚洲、非洲和欧洲等地区的研究确定为基因Ⅶd亚型引起，虽然没有出现世界性的全面大流行，但局部地区，特别是我国，出现大面积的免疫蛋鸡群产蛋率下降，肉鸡群高死亡率的情况，损失严重。

1 NDV毒力鉴定及基因型研究

根据对NDV全基因组的遗传进化分析，NDV只有一个血清型，但可以分为ClassⅠ和ClassⅡ2个不同分支。ClassⅠ型被认为是无毒株或弱毒株，ClassⅡ型包括了基本所有的疫苗毒株，从临床分离的致病毒株基本都是ClassⅡ型，按照F蛋白可将每个群分成9个不同的基因型。其中Ⅰ～Ⅳ型和Ⅴ～ⅤⅢ型基因组长度不同，分别为15 186 nt、15 192 nt。其中目前所用的疫苗毒株Lasota、clone30、N79等毒株均为基因Ⅱ型，当前被国内外学者认为处于NDV的第四次大流行，其主要病原为基因Ⅶ型NDV。

判定NDV强、弱毒的有传统的生物学特性鉴定法和分子生物学鉴定法。对NDV分离株测定，6周龄静脉接种指数（IVPI）、1日龄脑内接种指数（ICPI）、鸡胚最小致死量（MDT）是用于判定NDV毒力的生物学指标，孙静等对山东分离株NDV强毒株测定的MDT、ICPI、IVPI分别为47.4h、1.975、2.85[1]。分子生物学方法研究证实，NDV的毒力与F蛋白的氨基酸序列直接相关，强、弱毒株在氨基酸裂解位点上截然不同，F蛋白 112-117氨基酸序列为112R-RQ-K/R-R-F117、112G-R/K-Q-G-R-L117两种[2]，可作为判定分离毒株毒力的生物学标准，目前国内分离毒株强毒的确认均采用F蛋白112-117氨基酸序列作为分子生物学判定方法。

很多学者建立了其他分子生物学诊断方法来区分NDV强、弱毒株，主要是RT-PCR、荧光RT-PCR鉴别技术。陈安莉等参照NDV强、弱毒株F基因序列及其F基因的保守序列设计了3套LAMP引物，可以根据扩增结果来区分NDV强、弱毒株[3]，可供参考使用；殷俊磊等利用F基因保守区建立了雏鸡体内NDV强毒的荧光定量RT-PCR检测方法[4]。分子生物学方法可用于实验室检测，但准确率和可重复性需要进一步验证，耗时长、技术和设备要求高，对临床常规检测意义不大，因此并不适合于养殖一线的普通实验室使用。建立快速简便、准确、可重复性高的检测技方法，特别是应当开发易于操作的试剂盒，对基层兽医服务有很大的帮助，对GeneⅦ的监测和防治意义重大。

基因型的分类依据F基因的研究，研究发现在F基因334～1 682 nt之间限制性内切酶HinfⅠ、BstoⅠ和RsaⅠ位点分布的不同，通过3种酶切位点的差异用于NDV基因型的鉴定[5]。根据F基因47～435 nt序列推导的核苷酸序列绘制系统进化树，所反映的毒株之间的进化关系与限制性酶切位点分布所分析得出的结论是一致的，所以酶切位点分布分析的方法和F基因序列的系统进化树均可进行NDV的基因型的鉴定。2002年至今，对国内NDV的分子流行病学研究多是采用F序列的同源性及进化关系，扬州大学、国家新城疫参考实验室等公布的总计200多株强毒分离株96%以上属于基因Ⅶ型。

2 基因Ⅶ新城疫病毒毒力变化的分子生物学研究

不同基因型NDV的基因组大小略有不同，Ⅴ～ⅤⅢ型基因组15 192 nt，由融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶(HN)、核衣壳蛋白（NP）、基质蛋白(M)、磷蛋白(P)和大分子蛋白(L)6种结构蛋白组成[6]，其结构蛋白构成模式为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′。HN蛋白和F蛋白是研究最为深入的蛋白，研究认为HN蛋白与受体结合，介导F蛋白与细胞膜的融合，两者是和NDV毒力最为相关的结构蛋白，是NDV主要的致病因子[7]。

对F蛋白多肽裂解位点的研究发现，基因Ⅶ型强毒株F蛋白序列出现不同的基因点突变，有些突变为共同的突变点，也出现了分离株不一致的突变点；强毒株的标志为多肽裂解位点（F1和F2多肽裂解位点）的变化。据报道，从山东分离基因Ⅶ型强毒株，多肽裂解位点为112-RRQKRF-117，F基因核苷酸同源性与基因Ⅶ型鸡源毒株同源性在93.5%～98.3%，而与经典强毒株F48E9和Lasota株的核苷酸和氨基酸同源性却都比较低[1]；张会娟等对2株分离株全基因序列比对发现，与Genbank公布的29株基因Ⅶ型强毒株核酸序列同源性为91%～97%，与中国标准强毒F48E8同源性仅85%[8]。有报道发现了69、78两个位置的不同点突变，这些点突变与分离株的生物学毒力有很大关系，对于基因Ⅶ型毒株新的变异方向也具有很大研究价值。根据F基因推导的氨基酸序列出现了特异的残基替换，根据杨少华等研究，其推导的Ⅶ型F蛋白氨基酸序列发现了Ⅶd中Ⅰ52-V、Ⅶa、Ⅶc和Ⅶd中R101-K和A176-S氨基酸替换[9]；山东地区Ⅶd分离株的报道中也发现存在Q279-H和K387-R的氨基酸残基替换；同时F蛋白功能区也存在高度保守的糖基化位点和氨基酸残基，这与可能与F蛋白介导细胞膜融合，参与NDV对细胞的侵蚀性具有相关性，但保守的糖基化位点和氨基酸残基及其功能需要进一步确定，来自上海地区的研究报道了基因Ⅶ型强毒株之间RE位点分布的变化。需要注意的是基因Ⅶ型分离株在1 249 nt的RsaⅠ位点是其他亚型NDV没有的，在鹅源NDV分离株的研究中常见该酶切位点的报道，杨少华等所分离的3个毒株基因Ⅶd型毒株与报道的鹅源及鸭源NDV分离株之间核苷酸序列具有非常高的同源性，揭示鸭源、鹅源NDV与鸡源NDV在遗传学和流行病学上密切相关[9]。这些提示对NDV的研究要重视不同来源的重组带来的F基因的序列变化。

HN蛋白兼有血凝素和神经氨酸酶的活性，负责病毒粒子与其细胞受体的起始吸附和受体破坏活性，在免疫反应中作用极为突出。HN蛋白的球状区分布了所有单克隆抗体能够识别的神经氨酸酶活性位点、受体结合位点和抗原位点[10]，对NDV侵蚀性和逃避免疫的影响重大。HN蛋白的七肽重复序列(Heptad repeat region,HR)，可以能形成α螺旋，进而与F蛋白的相关区域形成的超螺旋具有改变F蛋白构象的功能[9]。HN蛋白受体结合关键区域在193-201、494、513-521、569、345-353位氨基酸位点，这些区域或其相近区域的氨基酸序列变化对毒株与单抗的反应性具有根本性的变化，疫苗株的203、342、394-395、508-509、514、570位氨基酸在基因Ⅶ型NDV分别突变为组氨酸（H）、天冬酰胺（N）、天冬氨酸和谷氨酸（E）、天冬酰胺和异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸（R）。研究认为关键性位点的改变决定了单克隆抗体抗原决定簇的空间构象，从而导致了与单抗反应性的改变[11]。国内学者研究还发现在强毒株的HN蛋白线性表位345-352aa处，出现347位氨基酸由E-K（G）的变化，77位氨基酸由天冬酞胺（N）突变为丝氨酸（S），这种变化导致了病毒与单抗的反应性降低，对于病毒对免疫的逃避具有很大的作用，这与免疫压力下的病毒变异应当具有很大的关系。

其他蛋白在NDV的毒力和生物学特性上的功能也在研究当中，目前已经发现另外四种结构蛋白、RNA编辑机制形成的W蛋白和V蛋白在NDV的致病机制中发挥了作用[12]，在NDV蛋白结构及其相互作用机制方面还有很多有待于深入研究的地方，这些蛋白的变化、及相互协同性对NDV毒力的影响和遗传变化需要进一步核实。

3 基因Ⅶ新城疫防控的关键和前景

免疫压力必然导致NDV的变异，出现的强毒株能够逃避传统疫苗的免疫，其物学特性、及分子生物学上的变化的研究是解决NDV免疫的关键，如上述病毒与单克隆抗体反应性的降低，氨基酸序的替换等均能导致疫苗免疫后不能形成有效地保护[8]。从分子学角度，疫苗毒株均属于基因Ⅱ型，与强毒基因Ⅶ型分离株遗传关系远，基因组同源性仅82%左右。基因Ⅶ型NDV引起不同日龄产蛋鸡群发生产蛋大幅下降的情况，肉鸡群中同样可以分离到大量的新城疫强毒株。流行病学调查显示，这些鸡群均经新城疫油佐剂苗多次免疫，具有较高的HI抗体水平，抗体均一度良好。笔者在临床中也多次发现产蛋鸡群免疫NDV油佐剂灭活苗后鸡群ND HI抗体水平达1∶64以上，仍不能有效抵抗ND强毒株的感染的情况。部分认为鸡群缺乏局部免疫抗体（黏膜免疫IgA）造成感染，但根据很多规模化鸡场系统的免疫程序和临床监测，可以确定NDV的变异造成了新城疫发生，即使很高的抗体，流行毒株和疫苗抗体之间的差异最终不能对基因Ⅶ型NDV形成有效防护。

不仅鸡源NDV强毒的变化，水禽分离株变化同样应引起高度重视，国内外报道的鸡源NDV分离株、基因Ⅶ型NDV分离株中Ⅶa、b、c、d和e亚型之间也有很多不同的氨基酸替换或其他方面的突变，前面已经详述，而国内的研究发现从鹅群分离到的基因Ⅶc亚型出现了1 249 nt RsaⅠ位点，这在其他NDV分离株上未见报道，所以怀疑新出现的很多具有较高致病力的NDV分离毒株很有可能来源于水禽，这些毒株与传统的Clone30、Lasota、CS2和V4疫苗株相比发生了很大的遗传改变，亲缘关系也比较远。同时根据临床经验，在鸡群免疫体系的压力普遍高于水禽，即水禽有可能成为NDV逃避免疫并产生新城疫变异毒株栖身场所，因此，应密切关注生产中NDV抗原性的变化，对基因Ⅶ型NDV做好病毒生物学的良好监测。

在疫苗研究中Cho等用流行株F、HN替换Lasota已经获得了致弱的重组毒株，并制备了灭活疫苗，与Lasota灭活苗相比产蛋率提高10%[13]；我国农业部畜禽传染病学实验室同样获得了基因Ⅶ型致弱毒株，毒力符合弱毒株标准，且不能造成细胞病变，致弱株制备活疫苗、灭活疫苗与Lasota相比均具有很大优势，能有效降低动物排毒率，显著减少泄殖腔病毒含量。从生产临床中看，新城疫的排毒是需要解决的问题，各种致弱毒株的临床效果需要进一步的验证，同时解决抗体检测中与Lasota的区别，对使用过程中病毒分子生物学的变化应当加以检测，避免重组出现的返祖、不同来源病毒的重组和出现更强毒株等问题，同时考虑从流行的代表性毒株筛选候选疫苗株配合常规疫苗免疫，控制NDV的排毒，才能真正有效的控制强毒NDV的流行。

在现在NDV基因Ⅶ型发生率高的情况下，关键是做好NDV的基础免疫，本实验室通过大量的田间试验，建议肉鸡免疫以活疫苗免疫配合灭活苗免疫为主，有条件的可以通过母源抗体测定确定免疫日龄，选择弱毒疫苗配合灭活疫苗注射；蛋鸡免疫关键是建立系统的免疫程序，在1～60日龄以活疫苗做好基础免疫，配合灭活疫苗提高抗体水平，同时关注法氏囊等免疫抑制病对NDV疫苗的影响，在开产强要高度重视灭活疫苗的使用，可选择具有针对基因Ⅶ型防治的灭活疫苗，确保产蛋高峰期来临之前具有很高的抗体水平，在开产以后定期补免新城疫、禽流感二联灭活疫苗。■（编辑：狄慧）

[1] 孙静,刁有祥,刘霞,等.1株鸡新城疫强毒株的分离鉴定及致病性[J].中国兽医学报,2012,32（5）:658-709.

[2] Panda A,Huang Z,Elankumaran S,etal.Role of Fusion Protein Cleavage Site in the Virulence of New Castle Disease Virus[J].Microb Pathog,2004,36（1）:1-10.

[3] 陈安莉,谢芝勋,周辰瑜,等.新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41（9）：917-922.

[4] 殷俊磊,伍祥龙,伍明山,等.雏鸡体内新城疫病毒强毒的荧光定量RT-PCR检测[J].中国兽医科学,2009,39（2）:159-163.

[5] 李春华,蒋凤英,魏晓锋,等.11株鸡新城疫病毒强毒株的分子特性[J].农业生物技术学报，2009,17（1）：36-40.

[6] Patti J M,Kim L M,Hon S I,etal.Evolutionary Dynamics of New Castle Disease Virus[J].Virology,2009,391（1）:64-72.

[7] Huang Z H,Panda A,Elankumaran S,etal.The Hemagglutin in Neuraminidase Protein of New Castle Disease Virus Determines Tropism and Virulence[J].Virology,2004,78（8）:4176-4184.

[8] 张会娟,张秀美,胡北侠,等.山东地区2株基因Ⅶ型新城疫病毒的全基因组测序及其序列分析[J].中国兽医学报,2013,33（7）: 985-990.

[9] 杨少华，胡北侠，许传田，等.三株新城疫病毒强毒株的生物学特性及全基因组序列分析[J]。病毒学报，2012,28（2）：143-150.

[10] 刘秀梵，胡顺林．新城疫病毒的进化及其新型疫苗的研制[J].中国兽药杂志,2010，44(1)：12-18.

[11] Peeters B P H,Olav S DE leeuw,Lwan V,etal.Generalation of a Recombinant Chimeric New castle Disease Virus Vaccine That Allows Serological Different between Vaccinated and Infected Aninal [J].Vaccine,2001,19:1616-1627.

[12] Peters R,Helps C R,Calvert E L,etal.Cytokinem RNA quantification in duodenal mucosa from dogs with chronic enteropathies by real-time reverse transcriptas epolymerase chain reaction[J].J Vet Intern Med,2005,19(5):644-653.

[13] Cho S H,Kwon H J,K im T E,et al.Characterization of a Recombinant New castle Disease Virus Vaccine strain[J].Clin Vaccine Immunol,2008,15(10):1572-1579.

Immunological and Biological Basis of GenotypeⅦNewcastle Disease Virus

Chen Shenmiao1，2，Wu Xueli3
（1.Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.,Ltd,Binzhou Shandong,256606; 2.Shandong Binzhou Bilaiwei Biological Technology Institute,Binzhou Shandong,256606；3.College of prataculture science,Nanjing Agricultural University,Nanjing Jiangsu,210095）

GenotypeⅦNewcastle disease has become the main Newcastle disease in China poultry breeding in the category,has become the focus in commercial broiler and laying hens in the clinical prevention,this paper carries on the analysis from the basis of molecular biology of Newcastle disease virus,combining with production practice,provide more valuable preventive measures for the breeding line.

GenotypeⅦ;Newcastle disease virus;Biological

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.01.032

陈申秒，男，（1983-），山东菏泽郓城人，助理研究员，硕士，从事动物传染病的诊断与防治工作，E-mail：csmiao.science@163.com。