胶质瘤相关性癫痫瘤组织中高迁移率族蛋白B1表达与痫性发作☆

王新军杨如意单峤李培栋吴建珩武跃辉王振

·论 著·

胶质瘤相关性癫痫瘤组织中高迁移率族蛋白B1表达与痫性发作☆

王新军*杨如意*单峤*李培栋*吴建珩*武跃辉*王振*

目的探讨胶质瘤相关性癫痫患者瘤组织中高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box-1，HMGB1)的表达。方法利用免疫组化半定量法检测82例胶质瘤相关性癫痫患者（胶质瘤并癫痫组）胶质瘤组织、80例胶质瘤不伴发癫痫的患者（胶质瘤非癫痫组）胶质瘤组织、80例难治性癫痫患者（非肿瘤癫痫组）致痫灶组织、20例行颅内减压术患者（阴性对照组）的正常脑组织中HMGB1的表达情况，统计分析实验组中HMGB1的表达及其临床意义。结果胶质瘤并癫痫组胶质瘤组织中HMGB1表达高于胶质瘤非癫痫组中胶质瘤组织(χ2= 16.944,P＜0.001)，低级别胶质瘤尤甚；高于非肿瘤癫痫组中致痫灶组织(χ2=26.094,P＜0.001)。胶质瘤非癫痫组胶质瘤组织中HMGB1的表达(χ2=32.273,P＜0.001)、非肿瘤癫痫组致痫灶组织中HMGB1的表达(χ2=22.236，P＜0.001)均高于阴性对照组中正常脑组织。胶质瘤并癫痫组中HMGB1的表达与胶质瘤相关性癫痫的持续时间(r= 0.365,P=0.001)、发作频率(r=0.531,P＜0.001)、胶质瘤的病理级别(r=0.265,P=0.016)呈正相关。结论HMGB1在胶质瘤相关性癫痫患者胶质瘤组织中高表达，且与癫痫发作情况关系密切，胶质瘤组织中HMGB1可能与其相关性癫痫的形成有关。

HMGB1胶质瘤 胶质瘤相关性癫痫

高迁移率族蛋白 B1(High-mobility group box-1,HMGB1)最早由Ellerman JE从小牛胸腺中分离得到[1]，是一种非组蛋白染色体结合蛋白，其广泛存在于真核细胞中。近年来，科学家致力于研究HMGB1表达与肿瘤、癫痫等临床常见疾病之间的关系，研究发现HMGB1在结肠癌[2]，胶质瘤[3]等肿瘤组织中高表达；另有研究，HMGB1-TLR4通路可能在人类原发性癫痫的发病和持续状态中发挥着重要作用[4]。本研究通过免疫组化法检测胶质瘤组织中HMGB1的表达情况，探究胶质瘤组织中HMGB1在胶质瘤相关性癫痫中的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取郑州大学第五附属医院神经外科2007年1月1日至2009年12月30日手术治疗的82例胶质瘤相关性癫痫患者胶质瘤标本为胶质瘤并癫痫组，同期手术治疗的80例不伴发癫痫的胶质瘤患者胶质瘤组织标本为胶质瘤非癫痫组，80例药物难治性癫痫患者致痫灶组织标本为非肿瘤癫痫组，20例行颅内减压术的脑组织标本为阴性对照组。研究所需标本及患者临床信息均已获患者、家属及我院伦理委员会同意。

1.2 免疫组化方法标本包埋后以3 μm厚连续切片，置于防脱剂预处理后的载玻片上。滴加HMGB1单克隆抗体前应用微波加热修复法进行抗原修复，修复液选择柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）；将切片微波高温加热2 min(加热至微小波动，90～95℃）后，立即转为保温8 min，待降至室温，用蒸馏水冲洗2次后，置于3%H2O2中8～10 min，再用蒸馏水冲洗2次。滴加HMGB1单克隆抗体4℃过夜(1：20)，PBS清洗后滴加生物素标记二抗，室温孵育20 min。PBS清洗，加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min。DAB显色剂显色，冲洗，苏木精复染，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后显微镜下观察。PBS液代替一抗染色做阴性对照。

1.3 免疫组化染色评估实验应用免疫组化半定量法，HMGB1免疫染色情况参照Wu D[5]等的方法，依据免疫组化染色率及染色程度综合评分得出。选择每张切片免疫反应较强区域，高倍视野（×400）观察5个不重复视野，计数HMGB1染色细胞，染色率=染色细胞数／总细胞数×100%。无染色细胞为0分，染色率≤25%为1分，染色率＞25%～50%为2分，染色率＞50%～75%为3分，染色率＞75%为4分；免疫染色程度依据细胞质染色深度评分：无染色为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分。最后以两种评分方式综合得分为最终得分，我们规定：阴性（-）：0分，低表达（+）：1～3分，高表达（++）：4～6分。

1.4 统计学方法所有数据采用SPSS17.0进行分析。利用χ2检验或Fisher确切概率法，Spearman秩相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 胶质瘤并癫痫组中癫痫发病情况、胶质瘤病理级别与HMGB1表达的关系胶质瘤并癫痫组胶质瘤组织中HMGB1的表达与癫痫持续时间(r=0.365，P＜0.001)、癫痫发作频率(r=0.531，P＜0.001)、胶质瘤病理级别(r=0.265，P=0.016)正相关，见表1。

2.2 胶质瘤并癫痫组、胶质瘤非癫痫组、非肿瘤癫痫组、阴性对照组中HMGB1的表达通过观察图1中免疫染色情况及表2中的统计分析，胶质瘤并癫痫组胶质瘤组织中HMGB1的表达高于胶质瘤非癫痫组中胶质瘤组织(χ2=16.944，P＜0.001)，和非肿瘤癫痫组中致痫灶组织(χ2=26.094，P＜0.001)，胶质瘤非癫痫组胶质瘤组织中HMGB1的表达高于阴性对照组脑组织(χ2=32.273，P＜0.001)，非肿瘤癫痫组致痫灶组织HMGB1的表达高于阴性对照组

脑组织(χ2=22.236，P＜0.001)。

2.3 胶质瘤并癫痫组中胶质瘤病理级别对伴发癫痫的影响胶质瘤并癫痫组中低病理级别胶质瘤(Low pathological grade glioma,LGG)组织HMGB1表达高于胶质瘤非癫痫组胶质瘤组织(χ2=18.360，P＜0.001)，而高病理级别胶质瘤(High pathological grade glioma,HGG)中HMGB1表达对是否伴发癫痫无统计学差异(χ2=2.649，P=0.104)，见表3。

3 讨论

图1 正常脑组织、致痫灶组织、胶质瘤组织中HMGB1的免疫染色（×400,标尺=20µm）。A：正常脑组织中HMGB1少量染色；B：非肿瘤癫痫组致痫灶组织中HMGB1的染色；C：胶质瘤非癫痫组中低级别胶质瘤（I级）组织HMGB1的染色；D：胶质瘤并癫痫组中低级别胶质瘤（I级）组织中HMGB1的染色；E：胶质瘤非癫痫组中高级别（IV级）胶质瘤组织中HMGB1表达；F：胶质瘤并癫痫组中高级别胶质瘤（IV级）组织中HMGB1的染色

表1 胶质瘤并癫痫组胶质瘤组织HMGB1表达与临床病理因素的关系[例]

表2 胶质瘤并癫痫组、胶质瘤非癫痫组、非肿瘤癫痫组、阴性对照组中HMGB1的表达[例]

表3 胶质瘤组织HMGB1的表达与不同病理级别胶质瘤是否伴发癫痫的关系[例]

癫痫是一种由多种病因引起，可反复、突然发作的神经功能异常症候群[4]。其中30%的患者长期规范服药，但仍不能完全控制，即药物难治性癫痫[6]，对于难治性癫痫通常采用外科手术治疗[7]。部分难治性癫痫病因明确，如颅内肿瘤、硬化，外伤，颅内血管畸形等，胶质瘤是最常见的肿瘤之一[8,9]。

关于癫痫与HMGB1的研究多着眼于原发性

癫痫模型中HMGB1表达，研究表明HMGB1可加重癫痫鼠模型海马组织损伤，促进海马组织P-gp过表达而增加癫痫发作的易感性[10]，HMGB1在Sombati癫痫细胞模型中随时间延长而表达增加，可能在癫痫的病理生理中起到重要作用[11]。本研究通过直接检测癫痫对照组患者致痫灶组织中HMGB1的表达情况，提示HMGB1的表达可能与癫痫发病直接相关，验证了以往的研究结论。本研究结合临床，可对研究对象进行后续随访，探究HMGB1表达与患者诊疗、预后及癫痫控制情况等的关系，可能为胶质瘤相关性癫痫的临床诊疗提供新靶点。

研究发现，HMGB1在胶质瘤组织中显著表达，并且与胶质瘤的病理级别密切相关[3]。本研究得出类似结论：胶质瘤非癫痫组胶质瘤组织中HMGB1的表达高于阴性对照组正常脑组织。不同的是，本研究中胶质瘤并癫痫组胶质瘤组织HMGB1的表达高于胶质瘤非癫痫组中胶质瘤组织。该结果提示，胶质瘤组织中HMGB1的表达情况直接影响是否伴癫痫发病。胶质瘤并癫痫组胶质瘤组织中HMGB1的表达与癫痫发作频率、癫痫持续时间呈正相关。研究表明，HMGB1可参与炎症反应而促发癫痫，抑制炎症因子及其受体可减少癫痫的发作频率、病理损害程度[12]。该结果进一步提示，胶质瘤组织中HMGB1的表达对其是否伴发癫痫起到重要作用。

本研究将HMGB1的表达与胶质瘤并癫痫组和胶质瘤非癫痫组中的LGG、HGG分别进行统计分析，发现胶质瘤并癫痫组LGG胶质瘤组织的HMGB1表达对胶质瘤是否伴发癫痫有统计学意义，而HGG胶质瘤组织中HMGB1的表达对其是否伴发癫痫无影响，这一结果由图1C与图1D，图1E与图1F的比较中不难得出，该结果提示：HMGB1对低级别胶质瘤是否伴发癫痫起到重要作用。该结果的可能原因：①低级别胶质瘤病程长，其释放HMGB1入细胞外环境，促进炎症反应，形成瘤周致痫灶，这就是手术需切除胶质瘤及瘤周致痫灶的病理基础[13]；②胶质瘤组织产生大量HMGB1，HMGB1与其受体，如TLR4[4]，RAGE[14]等形成异常放电通路，形成癫痫发作的基础。

综上所述，本研究利用免疫组化法检测HMGB1的表达，统计分析胶质瘤相关性癫痫与胶质瘤组织中HMGB1的关系，为胶质瘤相关性癫痫的研究提供新思路。但研究仍具有一定局限性，如未对胶质瘤周围致痫灶及患者血液中HMGB1的表达情况进行实验检测，故尚不能明确HMGB1的具体作用机制。后期研究中，我们将利用更多的实验方法，如western-blot,PCR,ELISA等进一步检测胶质瘤组织、胶质瘤周致痫灶组织、血液中HMGB1及其受体的表达情况，结合治疗后随访对胶质瘤相关性癫痫进行深入探究。

[1]Ellerman JE,Brown CK,de Vera M,et al.Masquerader：high mobility group box-l and cancer[J]．Clin Canc Res，2007,13 (10):2836-2848.

[2]Vtflp K,Brezniceanu ML,Bfisser S,et a1.Increased Expression of high mobility group box 1(HMGB1)is associated with an ele⁃vated level of the antiapoptotic c-IAP2 protein in human colon carcinomas[J].Gut,2006,55(2):234-242．

[3]王新军，周少龙，付旭东，等.人脑胶质瘤组织HMGB1表达临床意义初步分析[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(17): 1339-1342.

[4]Mattia M,Silvia B,Teresa R,et al.Toll-like receptor 4 and high-mobility group box-1 are involved in ictogenesis and can be targeted to reduce seizures[J].NAT MED,2010,16(4): 413-419.

[5]Wu D,Ding Y,Wang S,et al.:Increased expression of high mo⁃bility group box 1(HMGB1)is associated with progression and poor prognosis in human nasopharyngeal carcinoma[J].Pathol 2008;216(2):167-175.

[6]Perucca E,French J.&Bialer M.Development of new antiepi⁃leptic drugs:challenges,incentives,and recent advances[J].Lan⁃cet Neurol,2007,6(9):793-804.

[7]梅开勇，郝卓芳，欧阳小明．脑局灶性皮层发育不良相关性难治性癫痫的临床病理分析[J].中国神经精神疾病杂志,2010,36(7):419-422.

[8]Chang EF,Potts MB,Keles GE,et al.Seizure characteristics and control following resection in 332 patients with low-grade glioma[J].Neurosurg,2008,108(2):227-235.

[9]van Breemen MS,Vecht CJ,et al.Optimal seizure management in brain tumor patients[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2005,5 (3):207-213.

[10]黄贤径，郝劲博，狄晴，等.高迁移率族蛋白B1对癫痫大鼠海马P-糖蛋白表达的影响[J].南京医科大学学报（自然科学版）,2014,34(8):1029-1033.

[11]黄金山，吴厚，秦超，等.Sombati癫痫细胞模型中高迁移率族蛋白1的表达变化[J].中华神经医学杂志，2014,13(8): 817-819.

[12]Vezzani A,Balosso S,Ravizza T,et al.The role of cytokines in the pathophysiology of epilepsy[J].Brain Behav Immun,2008, 22(6):797-803．

[13]Englot D J,Han S J,Berger M S,et al.Extent of surgical resec⁃tion predicts seizure freedom in low-grade temporal lobe brain tumors[J].Neurosurg,2012,70(4):921-928.

[14]Zurolo E,Iyer A,Maroso M,et al.Activation of toll-like recep⁃tor,RAGE and HMGB1 signalling in malformations of cortical development[J].Brain 2011,134(4):1015-1032.

Expression of HMGB1 in glioma tissue of glioma-related epilepsy and epileptic seizures

.WANG Xinjun,YANG Ruyi,SHAN Qiao,LI Peidong,WU Jianheng,WU Yuehui,WANG Zhen.Department of Neurosurgery,The Fifth Af⁃filiated Hospital of Zhengzhou University,No.3 Kang-fu qian Street,Er qi District,Zhengzhou 450052,China.Tel：0371-66916449.

ObjectiveTo explore expression of HMGB1 in glioma tissue of glioma-related epilepsy patients.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of HMGB1 in the tissues from 82 glioma-related epi⁃lepsy patients(glioma-related epilepsy group),80 glioma patients(glioma without epilepsy group),80 intractable epilepsy patients(epilepsy control group)epileptogenic foci tissue and 20 normal controls(negative control group).ResultsHMGB1 in glioma tissue of glioma-related epilepsy group was significantly higher than that in glioma tissue of glioma without epilepsy grou p(χ2=16.944,P＜0.001),especially in low pathological grade glioma tissue.HMGB1 was higher in glioma tissue of glioma-related epilepsy group than in epileptogenic foci tissue of epilepsy control group(χ2=26.094,P＜0.001).Expression of HMGB1 in glioma tissue of glioma without epilepsy group(χ2=32.273,P＜0.001)and epileptogenic foci tissue of epilepsy control group(χ2=22.236，P＜0.001)was higher than in normal brain tissue of negative control group.In glioma-related epilepsy group,HMGB1 was positively correlated with seizures duration(r=0.365，P=0.001),sei⁃

HMGB1 Glioma tissue Glioma-related epilepsy

R651.1+1

A

2014-10-22）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.006

☆ 河南省重点科技攻关项目（编号：092102310090）；郑州市科技领军人才项目（编号：121PLJRC536）资助

* 郑州大学第五附属医院神经外科（郑州450052）

zures frequency(r=0.531，P=0.000)and pathological grade of glioma tissue(r=0.265，P=0.016).ConclusionsHMGB1 is highly expressed in glioma tissues of glioma-related epilepsy;HMGB1 expression is closely related with seizures;and HMGB1 in glioma tissue may contribute to the formation of glioma-related epilepsy.