Syntenin基因促进胶质瘤侵袭和迁移的分子机制☆

王兵钟东汤为学曾月成石爽张福安唐文渊

·论 著·

Syntenin基因促进胶质瘤侵袭和迁移的分子机制☆

王兵*钟东*汤为学*曾月成*石爽*张福安*唐文渊＊

目的探讨多配体聚糖结合蛋白（Syntenin）基因表达水平对胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响以及可能的分子机制。方法采用慢病毒RNA干扰技术敲低胶质母细胞瘤细胞株U-87中Syntenin基因表达水平；qPCR检测Syntenin mRNA表达水平，筛选最佳干扰序列；Transwell小室实验检测细胞的侵袭和迁移能力变化；粘附实验检测细胞的粘附能力变化；Western-Blot（WB）检测Syntenin、AKT、p-AKT和MMP-9的表达水平。结果qPCR结果显示，干扰组Syntenin mRNA表达水平显著低于空载组（P＜0.01），空载组与对照组相比无明显差异(P＞0.05)。侵袭和迁移实验结果显示，干扰组细胞的侵袭和迁移能力显著低于空载组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；空载组与对照组相比无明显差异(P＞0.05)。粘附实验结果显示，在各时间点，干扰组细胞的同种粘附率明显高于空载组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；异种粘附率均明显低于空载组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。WB结果显示，干扰组Syntenin、p-AKT和MMP-9的表达水平显著低于空载组，差异均有统计学意义（P＜0.05），空载组与对照组相比无明显差异(P＞0.05)；AKT表达水平在各组之间均无显著差异(P＞0.05)。结论在胶质瘤中，Syntenin可能通过上调AKT的磷酸化水平，经过相应的信号转导通路上调MMP-9表达水平，从而促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。

胶质瘤 Syntenin侵袭 迁移

胶质瘤的高度侵袭和迁移性是影响患者预后重要因素，对其侵袭和迁移相关分子机制研究已成为人们了解和治疗胶质瘤的前提[1]。Syntenin是从黑色素瘤中分离出来的含有2个PDZ结构域的支架蛋白。研究[2]发现，其表达水平与多种肿瘤的进展密切相关。课题组前期研究[3]发现，Syntenin在胶质瘤中的表达水平升高，其表达水平与肿瘤的病理级别成正相关。在此基础上，本研究进一步探讨Syntenin促进胶质瘤侵袭和迁移的分子机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象胶质瘤U-87细胞（购自上海生博公司）采用含10%FBS血清（Hyclone）的DMEM培养基，按1:100的比例常规加入青霉素-链霉素混合液，于37℃、5%CO2的孵箱中培养。HUVEC采用含10%FBS血清（Gibco）的1640培养基，培养条件同上。载体与主要试剂：携带Syntenin基因RAN干扰序列慢病毒4株（用于筛选最佳干扰株），空载病毒1株（上海生博公司）；RNA提取、逆转录和扩增试剂盒（Takara公司，日本）；Syntenin引物（Takara公司，中国大连）；兔抗人 Syntenin、MMP-9单克隆抗体（Abcam公司，美国）；兔抗人AKT、p-AKT（S473）单克隆抗体（CST公司，美国）；总蛋白提取试剂盒（上海碧云天公司）。

1.2 稳定转染细胞株的构建及最佳干扰序列的筛选取指数生长期U-87细胞接种6孔板，按MOI=30的比例加病毒液，培养48h后，用含有1μg/mL嘌呤霉素的筛选培养基筛选4d。按照说明书提取总RNA，测浓度后逆转录成cDNA，-20℃冰箱中保存备用。qPCR扩增按说明书进行，反应体系为25μL。引物为：Syntenin-F：5′-GTGGCTCCTGTA⁃ACTGGTAATGATG-3′；Syntenin-R：5′-CCAACCAATGAGGCTGGAGAAT-3′；β-actin-F：5′-CCAC⁃GAAACTACCTTCAACTCC-3′；β-actin-R：5′-GT⁃GATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。扩增条件：95℃预变性30s后，95℃变性5s，58℃退火30s，完成约40个循环后，逐渐升高温度，获取溶解曲线。分析Syntenin RNA/β-actin mRNA的相对表达水平，其中表达水平最低的细胞株对应的shRNA序列即为最佳干扰序列。实验重复3次。选取携带Syn⁃tenin shRNA最佳干扰序列的病毒转染U-87细胞建立的稳定株进行以下实验。实验分为干扰组，空载组和对照组。

1.3 Transwell小室检测细胞的侵袭和迁移能力在孔径为8μm的小室内铺用无血清DMEM稀释的基质胶（V基质胶：VDMEN溶液=1:5）；取指数生长期的各组细胞，将浓度为1.25×105个/mL的细胞悬液400μL细胞种入上室，下室加入含10%血清DMEM 600μL；培养20h后，取出小室，PBS洗涤，棉签拭去小室上层未穿出细胞和基质胶，固定并染色。迁移实验与侵袭实验方法和步骤基本相同，差别在于上室不铺基质胶，上室种入细胞后常规培养7h。观察照相，按每组不少于5个随机视野计数穿出细胞。实验重复3次。

1.4 MTT法检测细胞同种及异种粘附率变化取生长状态良好的对照组U-87和HUVEC细胞，调整细胞浓度至5×105个/mL，按每孔100μL种入96孔板；其中第1、7、12列不种，其余各列对应的A、B、C、D各行种入U-87细胞，对应的E、F、G、H各行种入HUVEC细胞。过夜培养，第2天取干扰组、空载组细胞，调整细胞浓度至3×105个/mL，按每孔100μL加入96孔板；其中第1、2列不加，3、4、5、6、7列加入干扰组细胞，8、9、10、11、12列加入空载组细胞。每隔30min吸去孔板3、8，4、9，5、10，6、11列孔内培养基，PBS 100μL洗涤两次并加入无血清DMEM 100μL；最后两列处理后，离心孔板，吸去2、7、12列培养基，加入100μL无血清DMEM；除去D、E行，MTT法检测各孔吸光度（A值），计算粘附率。荧光显微镜下观察D、E列细胞粘附水平并照相。粘附率计算公式=（实验孔A值均数-下层细胞A值均数）/上层所种细胞A值均数。实验重复3次。

1.5 Western-blot检测Syntenin、AKT、p-AKT和MMP-9表达水平按照说明书提取总蛋白，测浓度后保存在-20℃备用。将蛋白样品上样于10% SDS-PAGE电泳胶；电泳完成后，将蛋白转至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭2h；孵育一抗过夜，一抗稀释的比例如下：抗Syntenin-Ab（1:2000），抗AKT-Ab（1:1000），抗 p-AKT（1:1000），抗MMP-9-Ab（1:250），β-actin（1:2000）；TBST洗涤后孵育二抗2h；TBST洗涤后，采用ECL法显影，并分析条带灰度值，计算目的/内参灰度值之比。

1.6 统计学分析实验数据以（x±s）进行统计描述，采用SPSS 20进行数据分析，两组数据均数的比较采用独立样本t检验；多组数据均数的比较采用单因素方差分析，两组数据均数的多重比较采用LSD-t检验。检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 qPCR检测Syntenin mRNA表达水平 Syn⁃tenin mRNA表达水平分别为：干扰组0.15±0.04，空载组0.96±0.04，对照组0.87±0.10，差异有统计学意义（F=130.52，P＜0.01）。多重比较显示，干扰组Syntenin mRNA表达水平显著低于空载组（P＜0.01），空载组与对照组相比无明显差异(P＞0.05)。Syntenin mRNA最低表达水平组对应的shRNA序列为：5′-CCGGCCTATCCCTCACGATG⁃GAAATCTCGAGATTTCCATCGTGAGGGATAGGTTTTTG-3′；该序列即为最佳干扰序列（其他序列对应的数据未予显示）。

2.2 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力侵袭实验穿出细胞计数，干扰组61±8，空载组228± 26，对照组242±34；迁移实验穿出细胞计数，干扰组109±12，空载组224±22，对照组206±14。单因素方差分析显示，穿出细胞计数差异均有统计学意义（F=81.08，P＜0.01；F=68.37，P＜0.01）。多重比较显示，两个实验中，干扰组穿出细胞计数均低于空载组（P均＜0.01），空载组与对照组相比无显著差异（P均＞0.05）。侵袭和迁移细胞照片见图1。

2.3 MTT法检测细胞同种及异种粘附率变化在各时间点，干扰组细胞的同种粘附率明显高于空载组，差异均有统计学意义（t值分别为3.33、3.79、3.64、4.50，P均＜0.05）；而异种粘附率均明显低于空载组，差异均有统计学意义（t值分别为6.83、6.06、5.63、5.82，P均＜0.05）。各实验组MTT吸光值见表1，在90min时粘附细胞荧光照片见（图2）。

2.4 WB检测Syntenin、AKT、p-AKT和MMP-9表达水平目的蛋白与内参β-actin灰度值之比见表2。单因素方差分析，Syntenin（F=77.35，P＜0.01）、p-AKT（F=8.80，P=0.02）和MMP-9（F=5.59，P=0.04）表达水平差异均有统计学意义；AKT表达水平差异无统计学意义（F=0.69，P＞0.05）。多重比较显示，干扰组Syntenin、p-AKT和MMP-9的表达水平显著低于空载组（P均＜0.05），空载组和对照组相比均无明显差异（P＞0.05）；AKT表达水平在各组间无显著差异（P＞0.05）。WB照片见图3。

3 讨论

图1 敲低Syntenin对U-87细胞侵袭和迁移能力的影响（×100）

支架蛋白是一类本身不具备激酶和转录因子活性的蛋白质分子，其通过特殊的结构域连接两个或多个不能直接发生相互作用的信号分子，使信号得以特异而有序的转导，从而在细胞分裂、蛋白质运输及降解、基因表达等多种体内重要的生物学过程中发挥关键作用[4，5]。Syntenin是从黑色素瘤中分离出来的含有两个PDZ结构域的支架蛋白[2]。研究显示，Syntenin在黑色素瘤、乳腺癌，以及尿道上皮细胞癌中均呈过度表达，其表达水平与肿瘤的恶性程度及临床进展密切相关[2,6，7]。本课题组前期研究发现，Syntenin在胶质瘤中表达水平升高，并与胶质瘤的病理级别成正相关[3]。然而，Syntenin促进胶质瘤侵袭和迁移的分子机制尚不清楚。

胶质瘤细胞的侵袭和迁移是一个涉及多个步骤的复杂过程，包括肿瘤细胞的分离、细胞外基质的降解、细胞的运动以及侵入其他组织[1,8]。本研究显示，敲低胶质母细胞瘤细胞中Syntenin的表达水平，伴随MMP-9表达水平下降，细胞的侵袭和迁移能力显著降低。研究显示，MMP-9能够裂解整合素、CD44等肿瘤细胞表面重要的粘附分子，降解胶原蛋白、明胶蛋白等细胞外基质，从而促进胶质瘤的侵袭和迁移[1,9，10]。因此，Syntenin可能通过上调MMP-9的表达水平，促进细胞表面粘附分子的裂解和细胞外基质的降解，从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。

图2 90min时粘附细胞荧光照片（×100）

图3 敲低Syntenin对AKT、p-AKT和MMP-9表达水平的影响

表1 敲低Syntenin对各实验组的影响（MTT法，x±s）

表2 Syntenin、AKT、p-AKT和MMP-9在各组的表达水平（x±s）

本研究发现，敲低Syntenin表达水平后，AKT表达水平无明显变化，而AKT（S473）磷酸化水平显著降低，MMP-9表达水平显著降低，提示Syntenin能够通过上调AKT（S473）磷酸化水平，从而促进MMP-9的表达。本课题组前期研究发现，在低级别胶质瘤CHG-5细胞中转染表达人源性Syntenin的质粒后，伴随p-AKT水平升高，细胞的侵袭和迁移能力增强[11]。最近的研究显示，p-AKT能够激活IKK/IκB/NF-κB信号通路[12-14]，活化的NF-κB能够与MMP-9基因的启动子结合，上调MMP-9的表达水平[15，16]。因此，在胶质瘤细胞内，Syntenin可能通过上调AKT的磷酸化水平，激活IKK/IκB/ NF-κB信号通路，促进MMP-9的表达，从而促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。

虽然胶质瘤具有较强的侵袭和迁移能力，但是胶质瘤转移至脑外的发生率仅有0.4%～2%[1],而血管和淋巴管是胶质瘤发生脑外转移的必要途径，其中肿瘤细胞与内皮细胞的粘附是肿瘤转移的重要环节[17]。本研究发现，敲低Syntenin基因表达水平后，肿瘤细胞的同种粘附（干扰组、空载组细胞分别与对照组细胞粘附）能力显著增强，异种粘附（干扰组、空载组分别与HUVEC细胞粘附）能力显著降低。以上结果提示，Syntenin能够促进胶质瘤细胞的解离，增强肿瘤细胞与内皮细胞的粘附能力。因此，Syntenin在胶质瘤细胞发生脑外转移的过程中也发挥重要作用。

研究显示，在胶质瘤细胞中，Syntenin基于整合素信号通路，通过促进Src磷酸化，上调P38磷酸化水平，引起NF-κB活化，升高MMP2表达水平，从而促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移[18]。本课题组前期研究发现，在纤维连接蛋白（FN）的诱导下，Syntenin基于整合素信号通路，通过促进FAK和c-Src的活化，进而激活PI3K/AKT信号通路，从而促进胶质瘤细胞的迁移[11]。然而本研究显示，在无纤维连接蛋白（FN）诱导的条件下，敲低Syn⁃tenin基因表达水平，伴随AKT（S473）磷酸化水平降低，细胞的侵袭和迁移能力显著降低，提示在胶质瘤细胞中，Syntenin可能通过依赖整合素以外的信号通路，上调AKT（S473）磷酸化水平，从而促进细胞的侵袭和迁移。研究显示，在尿道上皮细胞癌中，过度表达的Syntenin能够激活c-Src，进而活化EGFR（Tyr845），从而激活PI3K/AKT信号通路[7]。因此，在胶质瘤中，Syntenin也可能通过激活EGFR信号通路，促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。

综上所述，Syntenin在胶质瘤侵袭、迁移和发生脑外转移的多个病理环节中均发挥重要作用，有望成为胶质瘤新的治疗靶点。然而，有关Syn⁃tenin在胶质瘤进展中的研究报道并不多见。因此，Syntenin在胶质瘤侵袭、迁移和发生脑外转移过程中的具体分子机制还有待于进一步研究。

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The study on molecular mechanism underlying the pro-invasion and pro-migration of Syntenin in gliomacells

ObjectiveTo investigate the effect of different gene expression levels of Syntenin on invasion and mi⁃gration of glioma cells and the underlying molecular mechanisms.MethodsLentiviral RNA interference was used to knockdown the expression of syntenin in U-87 cells.Real-time quantitative PCR was used to detect mRNA expression levels of syntenin.Transwell assay and adhesion assay were used to examine the invasion,migration and adhesion,re⁃spectively.Western-blot was used to detect the protein expression levels of Syntenin,AKT,p-AKT,and MMP-9.Re⁃sultsThe mRNA expression level of Syntenin was greatly reduced in interference group compared with empty vector group(P＜0.01).The ability of invasion and migration was much lower in interference group than in empty vector group（P＜0.01）.However,there were no significant differences in invasion and migration between empty vector group and con⁃trol group.The adhesion ability of glioma U-87 cells was much higher in interference group than in empty vector group（P＜0.05）.However,when U-87 cells were seeded on 96-wells coated with HUVEC,the adhesion ability was much lower in interference group than in empty vector group（P＜0.05）.The protein expression levels of Syntenin,p-AKT,and MMP-9 in interference group were markedly decreased compared with empty vector group（P＜0.05）.There was no signif⁃icant difference in expression of AKT protein between interference group and empty vector group(P＞0.05).ConclusionSyntenin may enhance the invasion and migration ability of glioma though up-regulation of p-AKT,which in turn pro⁃motes MMP-9 expression in a corresponding signal transduction pathway.

Glioma Syntenin Invasion Migration

R739.41

A

2015-01-13）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.05.008

☆ 重庆市科委自然科学基金科研项目（编号：cstc2011jjA10091）；财政部、卫生部国家临床重点专科建设项目[编号：财社（2001）170号]

* 重庆医科大学附属第一医院神经外科，重庆医科大学附属第一医院实验研究中心（重庆 400016）

（E-mail：zhongdongdp@sina.com）