豆瓣发酵瓣子中淀粉酶高产菌株的筛选及其酶活力的测定

董 丹，陈 燕，关统伟，车振明

（西华大学 微生物研究所，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都 610039）

豆瓣发酵瓣子中淀粉酶高产菌株的筛选及其酶活力的测定

董 丹，陈 燕，关统伟，车振明*

（西华大学 微生物研究所，食品生物技术四川省高校重点实验室，四川 成都 610039）

以郫县豆瓣不同时期发酵瓣子为原料筛选淀粉酶高产菌株，利用淀粉酶水解圈作为筛选模型，通过筛选培养及酶活力的测定，得到产淀粉酶活力相对较高的菌株DD23，为80.24 IU/mL。通过菌落形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，确定DD23为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。

淀粉酶；序列分析；蜡样芽胞杆菌；酶活力

淀粉酶是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂[1]，淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等水解α-1,4-糖苷键的酶。根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）与β-淀粉酶（EC3.2.1.2）。α-淀粉酶能水解淀粉分子内部α-1,4-葡萄糖苷键，水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖[2]。在食品、纺织、医药和饲料工业领域都有广泛运用[3-6]。β-淀粉酶是一种外切糖苷酶，从淀粉的非还原端开始裂解α-1,4-糖苷键，产物为麦芽糖和β-极限糊精，可应用于食品、酿酒等工业领域[7]。根据pH稳定性不同，淀粉酶又可以分为耐酸型、普通型和耐碱型3类。酸性淀粉酶一般具有较好的耐酸性，通常其最适pH值为4.0～5.0，且在较大的pH值范围内稳定；中性淀粉酶的最适pH值为6.0～7.0，其耐酸性明显低于酸性淀粉酶；而碱性淀粉酶在pH 9.0～11.0的碱性环境下具有高效催化活性和稳定性[8-9]。

郫县豆瓣是最为出名的四川调味品之一，被誉为川菜之魂[10-11]，以色泽油润红亮、酱香浓郁、味鲜辣醇和、外观黏稠绒实等特点著称[12-13]。传统郫县豆瓣以豆瓣、辣椒为原料，霉菌为主要微生物菌种，经自然制曲、天然发酵而成[14]。制曲的目的是通过米曲霉等菌种在原料上生长繁殖，以便于在发酵时利用它们所分泌的多种酶类对原料进行酶解，产生氨基酸态氮、糖类物质及有机酸，而这些物质对于豆瓣发酵风味物质的影响有着直接的关系。目前市售米曲霉是以产中性蛋白酶为主，酸性蛋白酶和淀粉酶活力低，因此本实验通过对制曲瓣子中高产淀粉酶菌株的筛选，以及将此用于高酶活复合菌剂的研制，提高豆瓣曲总酶活，改善豆瓣曲的酶系组成，有效提高豆瓣产品氨基酸态氮和还原糖含量，缩短发酵时间，提高产品品质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

郫县豆瓣：四川郫县恒丰和食品有限公司，发酵时间为2、5、8个月样品共3份，置于4℃冰箱保存，备用。

1.1.2 试剂

核酸染料（Goldview）、三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：上海生工生物工程有限公司；甘油、无水乙醇、异戊醇：成都市科龙剂化工厂；Ex Taq DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：大连Takara公司。

1.1.3 培养基

淀粉酶筛选培养基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨2 g，酵母膏5 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钾3 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，调pH值为7。

液体培养基：淀粉10 g，硫酸铵2 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、水1 000 mL，调pH值为7。

摇瓶发酵培养基：玉米粉0.5 g，淀粉0.3 g，硝酸钠0.3 g，磷酸氢二钾0.2 g，磷酸二氢钾1 g，牛肉膏1 g，水1 000 mL，调pH值为7。

1.2 仪器与设备

DHP-9052型恒温培养箱：上海益恒实验仪器有限公司；LIOOJS-500显微镜：北京赛多利斯仪器系统有限公司：1221655摇床：北京科思佳科技有限责任公司；UV757CRT紫外-可见光分光光度计：杭州汇尔仪器设备有限公司；Ty10TP100PCR仪：上海普迪生物技术有限公司；ChemiDoc-It凝胶成像系统：郑州南北仪器设备有限公司；LDZX-75KB型高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株初筛

取采集到的3份瓣子样品，用生理盐水稀释至10-1、10-2、10-3分别涂布于初筛平板，置于37℃和28℃下培养48 h，形成单菌落，挑选出透明圈明显的菌落，斜面编号保存，摇瓶发酵培养24 h，测定发酵液淀粉酶活力。

1.3.2 菌株复筛

取产酶活力大的菌株1环与100 mL无菌水中，60℃水浴稀释30 min。在筛选培养基上培养，待菌落长成后选择水解圈大，菌落小的菌株，进行发酵培养并测定淀粉酶活力。复筛4轮，选出产酶活力最高的菌株。

1.3.3 酶活测定-碘量法[15]

取5 mL质量分数0.5%可溶性淀粉溶液，在37℃水浴中预热10 min，加入适度稀释的粗酶液0.5 mL，37℃水浴振荡，准确反应5 min后，用5 mL 0.1 mol/L H2SO4终止反应。取0.5 mL反应液与5 mL稀碘液显色，在620 nm波长处测光密度值。以0.5 mL水代替0.5 mL反应液为空白，以不加酶液（加同体积的缓冲液）的管为对照。淀粉酶活力根据以下公式计算：

式中：R0、R分别表示对照和反应液的光密度值；D为酶的稀释倍数。

淀粉酶的酶活单位定义：在37℃，pH 6.0条件下5 min内水解1 mg淀粉的酶量为1个活力单位（IU）。

1.3.4 16S rDNA鉴定

菌株液体培养12 h，脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取采用改良十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）[16-17]法。得到的样品总DNA于-20℃保存。以提取得到的DNA为模板，细菌选择通用引物Eμ27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反应条件：95℃、4 min；95℃、60 s；56℃、60 s；72℃、120 s，35个循环；72℃、10 min。真菌选择引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反应条件：95℃、4 min；94℃、30 s、53℃、30 s、72℃、40 s，35个循环；72℃、7 min。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系为50μL：10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、Taq酶0.5μL、上下游引物各1μL、ddH2O 37.5μL、DNA模板1μL。PCR产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间40 min。纯化过程按照DNA胶回收试剂盒中的步骤进行，具体步骤参照OMEGA公司E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit试剂盒说明。PCR产物纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果提交美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）序列分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的初筛

从各样品中分离得到28株菌周围有明显水解透明圈，样品稀释涂布后大约在24 h后陆续长出单菌落。测量其透明圈半径，结果见表1。

由表1可知，筛选出的28株产酶菌株中，BZ16这株菌的水解圈半径最大，为3.25 cm，其次BZ23、BZ26、BZ27三株菌的水解圈大小仅次于BZ16，分别为3.24 cm、3.20 cm、3.15 cm，由此可以推断，BZ16产淀粉酶活力可能最高。

将28株产酶菌株进一步检测其产淀粉酶活力，结果见表2。

由表2可知，产淀粉酶活力最大的是菌株BZ16，为49.79 IU/mL，但菌株整体酶活力较低，还不能满足实际生产需要。

2.2 复筛结果

从初筛结果中挑选产酶活力最高的BZ16菌株进行分离纯化，在分离培养平板上进行培养，待菌落长成后选择透明圈较大、菌落小的菌株进行发酵培养并测定淀粉酶活力。4轮复筛之后，选择产酶活力较大的菌株作为本实验的目的菌株，复筛结果如表3所示。

经4轮复筛过后，得到28株单菌落，由表3可知，复筛得到的28株菌中产淀粉酶活力最大的菌株为DD23，淀粉酶活力为80.24 IU/mL，因此用菌株DD23作为试验菌株。

2.3 菌落的形态及生理生化鉴定结果

菌株DD23菌落在以淀粉为唯一碳源的分离培养基中生长，培养24 h形成乳白色菌落，菌落边缘不光滑，菌落黏稠，质地较密，有透明圈。菌株DD23进行生理生化鉴定，结果如表4所示。

由表4可知，菌株DD23为革兰氏阳性菌，最适生长温度为37℃，最适生长pH值为7.2，糖类发酵反应均为阳性，其中山梨醇反应、硝酸盐反应和吲哚反应均为阴性。

2.4 菌株的分子生物学鉴定结果

将DD23测序结果进行拼接过后，在Genbank数据库进行Blast序列比对，序列号为JX506729，经同源性对比与蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）相似度为100%，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》以及生理生化鉴定和分子生物学鉴定，最终确定DD23为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。

3 结论

淀粉酶作为一种重要的工业用酶，现已逐步应用于洗涤剂添加和纺织退浆等领域，取得了一定使用效果。在提高效率、提高产品质量、节约资源和环境保护等方面有着十分重要的作用。但现在对淀粉酶的研究主要集中在淀粉酶生产菌的筛选及其酶学性质的研究，而忽略了其产量不能满足实际工业生产的问题，这也阻碍了淀粉酶在实际生产中的运用前景。目前，郫县豆瓣的生产周期长，产品风味不稳定，这与发酵过程豆瓣中酶系的组成有着十分密切的关系，因此筛选出高产、稳定遗传的菌株对于缩短豆瓣发酵周期，改善豆瓣风味，节约生产成本非常重要，这也是目前必须解决的问题。本实验从郫县豆瓣发酵2、5、8个月的瓣子中筛选出的菌株DD23产淀粉酶活力最高，为80.24 IU/mL，经生理生化和分子生物学鉴定该菌为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）。此发现对于后续如何利用高产酶菌株实现缩短发酵周期，提高产品风味，研究产酶菌株代谢机理有着极其重要的作用。

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Screening of high yield amylase-producing strains from fermented soybean paste and the enzyme activity determination

DONGDan,CHEN Yan,GUAN Tongwei,CHE Zhenming*

(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihuan University,Chengdu 610039,China)

Differentperiods of Pixian soybean paste was selected as raw materialto screen high yield amylase-producing strains,and amylase hydrolysis circle was used as a screening model.Through the screening culture and enzyme activity determination,the results showed thatstrain DD23 had the highest enzyme activity which achieved 80.24 IU/ml.Through colonial morphology observation and 16S rDNA sequence analysis,the strain DD23 was identified as Bacillus cereus.

amylase;sequence analysis;Bacillus cereus;enzyme activity

TQ925

A

0254-5071（2015）02-0068-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.016

2014-12-19

教育部春晖计划项目（13205639）；食品生物技术四川省高校重点实验室（Szjj2013-045）；四川省教育厅基金项目（13205688）

董 丹（1989-），女，硕士研究生，研究方向为食品加工。

*通讯作者：车振明（1960-），男，教授，本科，研究方向为食品发酵技术。