两株极地真菌次级代谢产物的研究

闫凝星 方莎莎 刘靖堂 卢小玲 刘小宇 焦炳华

(第二军医大学生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)

0 引言

由于生长环境特殊，极地微生物具有特异的遗传和代谢特性，能够产生结构新颖、生理活性独特的新型次级代谢产物，近年来已成为极地天然产物研究的活跃领域［1-2］。

Articulosporasp.主要分布在赤杨木，菩提树，橡树等的树叶分解物［3-6］。中国极地研究中心发现Articulosporasp.能产生 β-葡萄糖苷酶［7］，日本学者 Hirosuke Sugahara从Articulosporasp.发酵液中提取到Art1，它是一种组氨酸激酶抑制剂，IC50为9.5 μM［8］。目前对Articulosporasp.的研究主要集中在生态学、物种多样性上，而对其在天然产物方面的研究很少。

目前关于青霉属天然产物的研究报道较多，它们的次级代谢产物包括生物碱，聚酮，青霉素衍生物，萜类，大环内酯类等，并具有抗菌、抗肿瘤、抑制蛋白酪氨酸磷酸酶等广泛的生物学功能［9-11］。

本实验室前期对中国极地研究中心提供的两株极地真菌Articulosporasp.Z1-1和Penicilliumsp.S-1-10的粗提物进行的生物学活性预试表明，其发酵产物具有抗细菌活性，并对多种肿瘤细胞株具有抑制活性。在此基础上，本文展开了这两株极地真菌的发酵产物的化学成分研究，以期得到结构新颖的具有生物学活性的化合物。

1 材料与方法

1.1 材料与菌株

1.1.1 仪器与材料

600 MHz核磁共振波谱仪，Bruker公司;Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent G1315BDAD检测器，安捷伦公司;6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，安捷伦公司;LC3000半制备高效液相色谱仪，北京创新通恒科技有限公司;ZQZY-C振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司;减压旋转蒸发仪，EYELA公司;薄层色谱硅胶(涂层厚度:0.20±0.3 mm，硅胶粉粒度:8±2μm≥80%，TLC:10-40μm)和柱层层析硅胶(硅胶粉粒度:8±2μm≥80%)，烟台江友硅胶开发有限公司;ODS反相硅胶层析填料，Merck公司;Sephadex LH-20凝胶层析填料，GE公司。

1.1.2 菌株

真菌菌株Z1-1分离于北极高纬度土壤样品，由中国极地研究中心提供，经PDA培养后菌落呈棕黄色绒毛状，无孢子形成，经18S rDNA序列测定及Blast分析比对后鉴定为节枝孢属(Articulospora)真菌［7］，菌种保存于第二军医大学生物化学与分子生物学教研室。

真菌菌株S-1-10分离于南极高纬度土壤样品，由中国极地研究中心提供，经PDA培养后菌落呈黄绿色，并有孢子形成，经18S rDNA序列测定及Blast分析比对后鉴定为青霉属(Penicillium)真菌(未发表数据)，菌种保存于第二军医大学生物化学与分子生物学教研室。

1.1.3 培养基和试剂

PDB培养基，由杭州微生物试剂有限公司生产。(GPY+NaCl 1%)培养基即葡萄糖10 g，胰蛋白胨2 g，酵母粉1 g，NaCl10 g，蒸馏水1 000 mL，其中胰蛋白胨和酵母粉由英国OXOID公司提供，其他化学试剂皆由国药集团化学试剂有限公司提供。总抗氧化试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养与发酵

1.2.1.1 菌株Articulosporasp.Z1-1的培养与发酵

种子培养:挑取菌株 Z1-1菌丝体接种于装80 mL PDB培养基的250 mL三角瓶中，在25℃，80 rpm条件下振荡培养4 d。

大批发酵:种子液按2%的接种量，接种于装有600 mL PDB培养基的2 L摇瓶中，在25℃，80 rpm条件下振荡培养1 d后静置27 d，共发酵28 d。经大批发酵，获得真菌Articulosporasp.Z1-1发酵液共72 L。

1.2.1.2 菌株Penicilliumsp.S-1-10的培养与发酵

种子培养:挑取菌株S-1-10菌丝体接种于装80 mL(GPY+1%NaCl)培养基的250 mL三角瓶中，在24℃，80 rpm条件下振荡培养4 d。

大批发酵:种子液按2%的接种量，接种于装有500 mL(GPY+1%NaCl)培养基的2 L摇瓶中，在24℃，80 rpm条件下振荡培养14 d。经大批发酵，获得真菌Penicilliumsp.S-1-10发酵液共85.5 L。

1.2.3 菌株粗提物的制备

发酵液离心后，加入等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯相40℃减压浓缩，共制得Articulosporasp.Z1-1 粗提物 4.5 g，Penicilliumsp.S-1-10粗提物9.3 g。

1.2.4 次级代谢产物的分离

1.2.4.1 菌株Articulosporasp.Z1-1次级代谢产物的分离

发酵液浸膏首先经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，氯仿∶甲醇=2∶1为洗脱剂，TLC检测洗脱进程，得到4个组分(Fr.1-Fr.4)。Fr.2通过ODS硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，30%(体积分数，下同)甲醇洗脱，减压蒸干得30%-2，30%-2经正相硅胶柱层析(三氯甲烷∶甲醇)，之后通过制备型薄层硅胶板纯化得到化合物1(3 mg)，50%-2经正相硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯)和制备型薄层硅胶板纯化，得到化合物2(6.0 mg)、化合物3(9.0 mg)和化合物4(8.0 mg)。Fr.3通过ODS硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，50%甲醇洗脱得50%-3，50%-3经ODS硅胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，40%甲醇洗脱得到样品，后经正相硅胶柱层析(三氯甲烷∶甲醇)，得到化合物5(6.5 mg)和化合物6(8.1 mg)。

1.2.4.2 菌株Penicillium.S-1-10次级代谢产物的分离

总浸膏进行减压硅胶柱层析，石油醚-丙酮-二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集不同组分，浓缩后经TLC检测合并相同的组分后得到9个组分。其中组分Fr.3经硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇梯度洗脱)和Sephadex LH-20凝胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇 =2∶1)层析分离得到化合物7(17 mg)。组分Fr.6经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱)和硅胶制备板分离纯化得到化合物8(5 mg)和化合物9(4.3 mg)。

1.2.5 核磁共振(NMR)

样品溶解于适当的氘代溶剂中，装入干净的核磁管中进行测试，测试项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC和 NOESY等。

1.2.6 质谱(MS)

分别取少量样品，用ESI-MS质谱仪进行检测。样品用甲醇溶解，进样量10μL，流动相为乙腈-水溶液。

1.3 生物学活性测试

1.3.1 化合物的细胞毒活性测试

采用MTT法［12］测定化合物对6种肿瘤细胞的生长抑制作用，取对数生长期的细胞，以(4-8)×104·mL-1接种于96孔板，每组设置3个复孔，分别加入终浓度为 100.0、50.0、25.0、12.5、6.2 和3.1μg·mL-1的样品，对照组选择终浓度为1%的DMSO，选取阿霉素作为阳性对照并设置空白对照，置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，加入5 mg·mL-1MTT，继续培养4 h后加入DMSO，用酶标仪(波长570 nm)测定各孔OD值，计算不同浓度对细胞生长的抑制率，利用SPSS软件计算半数抑制浓度IC50值。

1.3.2 纸片法抗菌活性测试

采用纸片法测定化合物对大肠杆菌(Escherichia coli(25922))，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis(6633))和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus(25923))的抑制作用，样品用甲醇溶解，氯霉素作为阳性对照，分别加在灭菌烘干的纸片(Φ6 mm)上，每个纸片上样品的加样量为50μg，待溶剂挥发后，置于涂有指示菌的固体琼脂平板上，28℃培养箱中培养16-18 h，观察有无抑菌圈产生及抑菌圈直径大小。

1.3.3 对稻瘟霉(Pyricularia oryzae)P-2b的抑制活性测试［13］

以稻瘟霉分生孢子以及菌丝形态变化为指标，对化合物进行活性测试。孢子芽管不萌发，孢子基本保持原有状态为抑制活性，用“o”表示;孢子不萌发、萌发或菌丝生长但形态发生严重变化为强变形活性，孢子不萌发、萌发或菌丝生长，但形态发生严重变化，为强变形活性，用“+++”表示;孢子萌发或菌丝生长，但形态发生中等强度的变化，为中等变形活性，用“ ++”表示;菌丝生长，但生长状态异常，为弱变形活性，用“+”表示;菌丝正常生长为阴性，用“-”表示。把稻瘟霉菌丝体生长开始受到抑制或不再生长的化合物浓度定义为最低抑菌浓度(MIC)，即稻瘟霉大致呈现“+”状态时的浓度(图1)。

图1 稻瘟霉孢子/菌丝不同程度抑制/变形图Fig.1.The different degree inhibition or deformation figure of Pyriculariaoryzae sporule ormycelium

1.3.4 总抗氧化活性测试

采用总抗氧化能力检测法(ABTS快速法)测定化合物的总抗氧化能力。ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的 ABTS+，在抗氧化物存在时ABTS+的产生会被抑制，在414 nm测定ABTS+的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。阳性对照物是一种维生素E的类似物Trolox，总抗氧化能力定为1，相同浓度情况下，其它物质的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍数来表示。

2 实验结果

通过各种分离手段，从两株极地真菌中共分离得到9个化合物，根据1D-NMR、2D-NMR和MS实验数据鉴定了化合物1-9的结构(图2)。

2.1 结构鉴定

化合物1为黄色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm/z:273［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)， δH:11.8(1H， s)，11.3(1H， s)，7.21(1H，d，J=3.9 Hz)，6.72(1H， d，J=3.9 Hz)，6.64(1H， d，J=3.9 Hz)，6.61(1H，d，J=3.7 Hz)，3.90(3H，s)， 2.73(3H，s);13C-NMR(CD3OD)， δC:138.5(C-1)， 25.0(CH3-1)， 117.6(C-2)，158.5(C-3)，101.6(C-4)，152.6(C-4a)，164.7(C-6)，99.2(C-8)， 166.2(C-9)， 55.8(OCH3-9)， 103.4(C-10)，137.8(C-10a)，108.8(C-10b)。此波谱数据与文献［14］报道的基本一致，故鉴定为 3，7-二羟基-9-甲氧基-1-甲基-苯并［c］色烯-6-酮。

图2 化合物1-9的结构式Fig.2.The chemical structure of compounds 1-9

化合物2为白色晶体，FeCl3显紫色。ESI-MSm/z:125 ［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)，δH:6.62(1H，d，J=8.4 Hz)，6.57(1H，m)，6.45(1H，dd， J=8.4 Hz， J=3.6 Hz)，2.09(3H， s);13CNMR(CD3OD)， δC:14.9(CH3-2)，149.6(C-1)，125.1(C-2)，117.0(C-3)，147.9(C-4)， 112.5(C-5)，115.0(C-6)。与文献［15］报道的波谱数据一致，故鉴定为1，4-二羟基甲苯。

化合物3为无色针状晶体。ESI-MSm/z:125［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)，δH:7.15(1H， t，J=8.4 Hz)，6.80(1H，m)，6.79(1H，m)，6.67(1H，dd，J=7.8 Hz，J=2.4 Hz)， 4.50(2H， s);13CNMR(CD3OD)， δC:156.8(C-1)，114.3(C-2)，142.4(C-3)， 118.2(C-4)，129.1(C-5)，113.6(C-6)，64.0(C-7)。 以上数据与文献［16］报道的波谱数据基本一致，故鉴定为间羟基苄醇。

化合物4为白色晶体。ESI-MSm/z:139［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)， δH:7.05(2H， d，J=9.0 Hz)，6.71(2H， d，J=8.4 Hz)， 3.67(2H， t，J=7.2 Hz)， 2.71(2H， t，J=7.2 Hz);13CNMR(CD3OD)，δC:156.2(C-1)， 114.9(C-2，C-6)，129.8(C-3，C-5)， 129.4(C-4)，38.8(C-7)，63.8(C-8)。与文献［17］报道的波谱数据一致，故鉴定为对羟基苯乙醇。

化合物5为淡黄色油状物质。ESI-MSm/z:279［M+H］+。 根据1H-NMR，13C-NMR和 MS数据，可判断此化合物结构完全对称，13C-NMR和DEPT谱上的芳香区显示有2个次甲基、2个季碳、3个亚甲基和1个甲基信号，其分子式推导为C16H22O4，根据13C-NMR谱可知该化合物含有1个苯环2个酯羰基和2个丁氧基。综合上述信息并与文献数据［18］进行比较，化合物5的结构推导为邻苯二甲酸二丁酯。

化合物6为黄色油状物质。ESI-MSm/z:315［M-H］-。1H-NMR(CD3OD)， δH:12.25(brs)，10.5(brs)，7.62(1H， d，J=15.8 Hz)，7.48(1H，d，J=15.8 Hz)，7.01(1H，d，J=2.2 Hz)，6.78(1H， d，J=2.2 Hz)，5.55(brs)， 4.60(brs)，3.89(3H，s);13C-NMR(CD3OD)， δC:160.8(C-1)， 107.5(C-2)，154.4(C-3)， 106.9(C-4)，120.5(C-5)，125.7(C-6)， 149.2(C-7)，167.2(C-8)， 180.1(C-9)，151.1(C-10)，106.9(C-11)，155.8(C-12)，117.4(C-13)， 117.4(C-14)， 62.7(CH2OH-3)，52.6(CH3)。波谱数据与文献［19］报道一致，故鉴定该化合物 1，7-二羟基-3-羟甲基-8-甲氧基-二苯并［b， e］氧杂卓-13，14-二酮。

化合物7为黄色油状物质，ESI-MSm/z:391［M+H］+。1H-NMR(CD3OD)，δH:9.20(2H， d，J=3.6 Hz)，9.04(2H，d，J=3.6 Hz)，5.72(4H，m)，3.22(2H，m)，2.89(16H，m)，2.43(6H，m);3C-NMR(CD3OD)， δC:128.8(C-1， C-6)，130.9(C-2，C-5)，132.5(C-3， C-4)，167.7(C-7， C-7')， 68.2(C-9， C-9')， 38.7(C-10， 10')，30.4(C-11， C-11')， 28.9(C-12， C-12')， 23.0(C-13， C-13')，14.0(C-14， C-14')，23.7(C-15，C-15')， 10.9(C-16， C-16')。 波谱数据与文献［20］报道一致，故鉴定该化合物邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯。

化合物8为黄色油状物质，ESI-MSm/z:289［M+H］+。 根据1H-NMR，13C-NMR，和 DEPT谱的信号，可推出该化合物含有1个甲基，一个醛基，和12个亚甲基，δH7.84(2H，J=11 Hz)和6.97(2H，J=10.5 Hz)为对位取代芳环上的质子信号，再结合MS数据，可推断出该化合物结构为4-十三烷基-苯甲醛。

化合物9为黄色粉末状物质，ESI-MSm/z:249［M+Na］+。1H-NMR(CD3OD)， δH:5.34(2H，m)， 2.2(2H， t，J=11.2 Hz)， 2.02(4H， m)，1.60(2H， t，J=10.9 Hz)， 1.24(12H， m)， 0.90(3H， t，J=10.3 Hz);13C-NMR(CD3OD)， δC:179.7(C-1)，131.2(C-8)，131.1(C-7)，36.9(C-2)，33.3(C-9)， 30.5(C-10)， 30.2(C-11)，30.1(C-12)，29.8(5)，28.4(C-4)，27.2(C-3)，24.0(13)， 14.7(C-14)。 波谱数据与文献［21］报道一致，故鉴定该化合物(Z)-7-十四烯酸。

2.2 化合物的细胞毒活性测试

采用MTT法测定化合物对6种肿瘤细胞的生长抑制作用，结果显示该化合物2对胰腺癌SW1990细胞株和乳腺癌MCF-7细胞株具有较强细胞毒活性，IC50分别为18.6和9.68μg·mL-1见表1。

表1 化合物2的体外细胞毒活性(IC50，μg·m L-1)Table 1.The in vitro cytotoxicities of compounds 2

2.3 对稻瘟霉的抑制活性测试

实验结果表明化合物1和4对稻瘟霉具有抑制活性，MIC值为31.2和15.6μg·mL-1。

2.4 纸片法抗菌活性测试

实验结果显示化合物2表现出较强的抗菌活性，其抗大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为13 mm、18 mm和14 mm，氯霉素对此三种指示菌的抑菌圈直径分别为17 mm、22 mm和21 mm(图3)。

图3 化合物1-6的抗菌活性(左中右分别为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌)Fig.3.Theantibacterial activity of compounds 1-6(the left，middle and right represents Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus)

2.5 抗氧化活性测试

总抗氧化能力的实验结果显示，化合物3具有较强的总抗氧化能力，总抗氧化能力为阳性对照物Trolox的2.4倍。

3 讨论

本项研究从极地真菌Articulosporasp.Z1-1和Penicilliumsp.S-1-10中分离得到9个次级代谢产物。化合物1-6均首次从Articulosporasp.属分离。化合物1由Meng等首次从Hyalodendriellasp.Ponipodef12中分离，有较弱的抗菌活性、抗线虫活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性［7］，本研究发现它有中等强度的抗稻瘟霉活性。化合物2常被用作医药、染料、颜料中间体，是较好的抗氧化剂，也是一种新型阻聚剂，本文还发现其对多种肿瘤细胞株抑制作用较强，并有较强的抗菌作用，具有抗肿瘤和抗菌的研究价值和应用前景。化合物3有较强的抗氧化活性，有望开发成为抗氧化剂。本实验从节枝孢属Z1-1中分离到了具有强抗氧化活性的酚类化合物，也许能部分解释极地微生物对紫外辐射的抗性的机制。从Penicillium.S-1-10中分离的化合物8是新的天然产物。另外，本文首次系统的报道了Articulosporasp.次级代谢产物，以上研究为极地微生物资源的进一步开发利用提供了重要依据。

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