铵硝营养对高粱根系细胞膜质子泵的影响

魏天娇, 周金泉, 张明超, 魏志军, 朱毅勇

(南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 210095)

铵硝营养对高粱根系细胞膜质子泵的影响

魏天娇, 周金泉, 张明超, 魏志军, 朱毅勇*

(南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 210095)

高粱； 铵硝营养； 细胞膜质子泵； pH

铵和硝是作物吸收的两种主要氮素形态[1]。在旱地土壤中，硝化作用强烈，铵态氮肥易转化为硝酸盐，因此大多数旱地作物以硝态氮的吸收为主[2]。但是在酸性与淹水土壤中，硝化作用受到抑制，因此在这些土壤上生长的作物以铵态氮的吸收为主[3]。从植物营养的角度来看，吸收铵态氮的过程不需要耗能，但是除了水稻等一些作物能在单一铵态氮营养正常生长外，大多数植物会发生铵中毒[4]。

铵中毒的原因很多，其中最明显的一个原因就是大量吸收铵态氮后导致的根际强烈酸化[5,6,7]。研究表明，水稻在这种情况下能够提高根系细胞膜质子泵活性[8]，来维持膜电位。但是到目前为止，还不清楚这是植物在铵态氮营养下的普遍生理反应，还是水稻所特有的生理适应能力。虽然在大麦根系中也发现，铵态氮营养下质子泵活性增强[9]，但是在该试验中没有考虑根际pH值，因此还无法肯定究竟是铵还是pH所造成的结果。此外，研究也发现，硝态氮营养下的玉米根系的细胞膜质子泵活性也会受诱导而升高[10]。但是，由于类似的试验并没有将所有因素均考虑在内，并且在同一作物上进行试验，因此，究竟哪种因素对质子泵的影响更大，其可能的原因是什么？则到目前为止还缺少充分的研究数据。

植物细胞膜质子泵通过水解ATP产生能量，将氢离子泵出细胞，因此又叫H+-ATPase，其作为细胞膜上的一级运输蛋白，不仅维持细胞质pH的稳定，而且还建立了细胞膜电位，并为各种养分物质的运输提供质子驱动力[11]，在植物营养生理中具有重要的意义。因此，本文选用高粱这种旱地作物，通过在铵硝营养下培养并调控根际pH，然后分离细胞膜、测定质子泵活性，进一步探索植物根系细胞膜质子泵对铵硝及根际pH的反应，为研究植物的铵硝营养机制提供更多借鉴。

1 材料与方法

1.1 高粱培养

将高粱分别用N 1 mmol/L，即0.5 mmol/L(NH4)2SO4和Ca(NO3)2作为氮源培养，不调节营养液的 pH。每次更换营养液后，间隔12 h测定pH，记录4 d内营养液的pH变化。由于铵态氮营养下，根际酸化，营养液pH下降为3，而硝态氮营养下，根际碱化，营养液pH上升为7。因此，为了区分是铵、硝营养，还是由于铵硝营养下不同根际pH对质子泵的影响，将另一组同样处理下的高粱用pH 自动调节设置(NPH-660 NDE，Nissin，Japan)把硝态氮营养液的pH 值控制在3，而将铵态氮营养液的pH控制在7，分别用0.1 mmol/L NaOH 或0.05 mmol/L H2SO4实时滴定来调节。

1.2 测定和分离方法

1.2.1 高粱根系细胞膜分离 根系细胞膜分离方法参照Yan等[12]的方法，略加修改。高粱培养到三周时，采集根系20 g左右，加入4倍体积预冷的研磨液，在冰浴中研磨，匀浆用4层纱布过滤后，11500×g下离心10 min，弃沉淀。上清液于87000×g下离心35 min,弃上清液，沉淀用6 mL缓冲液充分悬浮后，加入由右旋糖苷(DextranT500, Sigma)和聚乙二醇(PEG23350, Sigma)的水溶液组成的两相分离系统并混匀。4℃、720×g下离心，每次离心结束将分为两层的上相转移到新的两相系统中混匀，再依次离心23、15、10、5 min，将最后一次离心后从上相中收集到的膜蛋白用BTP缓冲液稀释6倍至6倍以上，151200×g下离心40 min。收集到的膜蛋白用1～2 mL BTP缓冲液溶解后分装，置于-80℃下保存。以上所有操作所用离心机为BECKMAN COUL-TER OptimaTML-80 XP，转头为SW32 Ti。

1.2.2 蛋白质含量测定 用Bradford(G250)比色法测定蛋白质含量[13]。

1.2.3 细胞膜H+-ATPase水解活性的测定 测定H+-ATPase水解活性参照Yan等[12]的方法。在相同条件下，以测定失活的膜蛋白为空白，根据单位时间内每1 mg膜蛋白水解产生的无机磷作为活性单位。

通过采用不同的抑制剂测定后，我们得到纯度在94%以上细胞膜，为了避免其他可能存在的生物膜上质子泵的影响，本试验测定中均加入NaN3、NaNO3、Na2MoO4三种抑制剂。

1.2.4 细胞膜蛋白凝胶电泳和免疫印迹试验 用SDS-PAGE分离细胞膜蛋白，具体方法参照狄廷均等[14]，然后将分离后的蛋白质电转移到PVDF膜上，经TBST 20℃室温封闭l h后加入一抗(日本名古屋大学木下俊则教授赠送的植物细胞膜H+-ATPase多克隆抗体)孵育，再用辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(Sigma)孵育，最后用ECL试剂盒(KPL公司)检测。

1.3 数据分析方法

所有数据采用SAS软件中LSD(P<0. 05)进行处理间双重比较分析。数据均用3次独立试验的平均值±标准误差(Mean±SE)表示。

2 结果与分析

2.1 铵、硝态氮营养下高粱根系细胞膜上的H+-ATPase活性的比较

2.2 铵硝营养下高粱根系细胞膜H+-ATPase的Vmax与Km比较

2.3 铵、硝态氮营养下高粱根系细胞膜H+-ATPase蛋白浓度分析

为了研究细胞膜H+-ATPase活性差异产生的原因，本试验分析了其单位膜蛋白中H+-ATPase蛋白数量变化。不同处理下的根系细胞膜蛋白(15 μg)经SDS PAGE凝胶电泳分离后转到PVDF膜上后与H+-ATPase的多克隆抗体发生反应后可以看出(图3)，铵态氮营养下根际pH 3时，免疫印迹最深，而硝态氮营养下根际pH 7时，免疫印迹最浅，硝态氮营养pH 3时，质子泵蛋白的浓度有所增加，而铵态氮营养pH 7时质子泵蛋白的浓度比 pH 3时有所减少。结合图1、图2的结果，说明单位膜蛋白中质子泵蛋白的浓度是决定其活性差异的主要原因。

3 讨论

铵态氮营养下根际pH降低到3，而硝态氮营养下根际pH上升至7，在此条件下，铵态氮营养下的高粱根系细胞膜H+-ATPase活性要显著高于硝态氮营养，这与我们前期研究水稻的结果类似[14]。但是，在硝态氮营养下人为的将根际pH调至3，则细胞膜H+-ATPase活性比pH 7环境下要高(图1)。由于硝态氮被根系细胞吸收后主要是运输到地上部分，或是贮存在液泡中，即使在根系中被还原，其还原过程中并不产生H+[15-16]。因此可以推断，在硝态氮营养下，高粱根系细胞膜H+-ATPase活性升高完全是由于外界pH 降低导致的。这说明根系细胞膜质子泵具有适应根际酸化的机制。

但是，在铵态氮营养下，当根际pH上调到7以后，细胞膜H+-ATPase活性降低了，这同样说明了细胞膜H+-ATPase是适应铵态氮吸收后根际酸化导致了活性的变化。本试验发现，无论是在pH 7还是pH 3的情况下，铵态氮处理的根系细胞膜H+-ATPase活性均比硝态氮处理要高 。这个结果说明，一方面细胞膜H+-ATPase活性确实受到外界pH的影响而变化;另一方面也说明在铵态氮营养下，还存在其他的原因，导致高粱细胞膜H+-ATPase活性仍然要保持在一个相对较高的水平上。由于铵态氮吸收以后可以直接在细胞中同化为氨基酸，并产生H+，而细胞膜H+-ATPase的一个重要生理功能是将细胞中多余的H+排出体外，以维持细胞质中的pH稳定[17]。因此推断，在铵态氮营养下，高粱根系细胞内部无法消耗掉铵同化产生的氢离子，因此需要通过提高质子泵活性将多余的氢离子泵出细胞。

从生理生化的水平来看，酶活性高低的原因取决于两方面:一是单位面积细胞膜上酶蛋白的数量差异;二是其同工酶的组成发生变化，当然也可能是上述两种情况同时发生[18]。通过在测定时用不同的pH环境研究H+-ATPase活性后发现，在铵态氮营养下，其最高活性范围在pH 6.0～6.2，而在硝态氮营养下则上升为pH 6.0～6.4。这说明，在铵硝营养下，其同工酶的组成可能发生了变化。此外，酶动力学的测定结果还发现，铵态氮营养pH 3环境下高粱根系细胞膜上H+-ATPase的Km值最低，这说明H+-ATPase在这种情况下亲和能力最强，但是在铵态氮营养pH 7时，其亲和性却比硝态氮营养下要低，这也说明其同工酶的组成发生了变化，导致其亲和能力发生了改变。由于细胞膜H+-ATPase是由一个多基因家族编码的[19]，因此要具体分析哪些同工酶发生了变化还需要从分子生物学的水平上研究其同源基因的表达才能确认，这还有待进一步研究。

通过Western blot 的结果(图3)发现，铵态氮营养pH 3时，免疫印迹最深，而硝态氮营养下根际pH 7时最浅，其他两种处理的结果与上述H+-ATPase活性的变化一致，这说明单位膜蛋白数量上，质子泵酶蛋白数量的高低是决定其活性的主要原因。

4 结论

除了外界pH因素外，铵硝营养本身也是影响高粱根系细胞膜质子泵活性的一个重要原因，尤其是铵态氮营养下，细胞膜质子泵不仅要响应根际低pH对其的影响，同时还要响应细胞内铵态氮同化产生的氢离子对其的影响。而水稻等耐铵作物似乎并没有受到细胞内铵态氮同化产生的氢离子对其的影响，其细胞中存在着调节pH的其他机制，因此只要外界pH相同时，铵或硝营养下水稻根系细胞膜质子泵活性之间没有差异[8]。因此，这可能是喜硝作物高粱与喜铵作物之间的一个重要的差别，是不同作物根系细胞膜质子泵对铵态氮营养的不同响应机制，其中还涉及到质子泵同工酶的变化，相关的研究有待进一步从分子水平上进行分析。

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WEI Tian-jiao, ZHOU Jin-quan, ZHANG Ming-chao, WEI Zhi-jun，ZHU Yi-yong*

(CollegeofResoursesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

sorghum; ammonium and nitrate; plasma membrane H+-ATPase; pH

2014-06-20 接受日期: 2014-11-03 网络出版日期: 2015-05-21

国家自然科学基金(31172035)；教育部新世纪优秀人才项目(NCET-11-0672)；国家级大学生创新创业训练计划(201410307023)资助。

魏天娇(1992—)，女，吉林公主岭人，硕士研究生，主要从事植物营养生理与土壤微生物方面的研究。 E-mail: 2012103158@njau.edu.cn。 *通信作者E-mail: yiyong1973@njau.edu.cn

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1008-505X(2015)05-1178-06